Comparación de tres coeficientes de similitud para análisis con marcadores moleculares AFLP en Lupinus mutabilis Sweet

Comparison of three coefficients of similarity for analysis with molecular markers AFLP in Lupinus mutabilis Sweet

Roberto F. Aubert-Carreño^1,
*; Mercedes Maritza Quispe-Flórez²; Griselda Muñiz-Durán²; Raúl Humberto Blas-Sevillano³

¹Estación Experimental Agraria Andenes, Dirección de Desarrollo Tecnológico, Instituto Nacional de Innovación Agraria, Estación Experimental Agraria Andenes. Av. Micaela Bastidas N°314-316, Wanchaq, Cusco 08002, Perú.

²Facultad de Ciencias. Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco. Av. de la Cultura, Nro. 733, Cusco, Cusco 08001, Perú.

³Facultad de Agronomía, Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. La Molina s/n - La Molina, Lima 15012, Perú.

*Autor corresponsal: rober_auber@hotmail.com (R. F. Aubert-Carreño)

ID ORCID de los autores

R.F. Aubert-Carreño: https://orcid.org/0000-0002-3350-0947 M.M. Quispe-Flores: https://orcid.org/0000-0003-2682-6188

J.G. Muñiz-Durán: https://orcid.org/0000-0001-9988-4827

RESUMEN

Se utilizaron tres coeficientes de similitud: Simple Matching (SM), Jaccard (J) y Dice (D) para analizar la variabilidad genética mediante el uso de marcadores moleculares AFLP en 48 accesiones de Lupinus mutabilis Sweet, 26 provenientes del Departamento de Cusco y 22 de departamentos y países distintos (Ecuador y Bolivia). A partir de matrices de similitud, se generaron dendrogramas con cada coeficiente, mediante el método UPGMA a través del software NTSYSpc versión 2.01, analizándose y comparándose entre sí, obteniendo un Coeficiente de correlación cofenética (r): SM=0,68674, J=0,79116 y D=0,79332; un Índice de consenso (Clc): SM–J=0,52, SM–D=0,52 y J–D=0,93; y niveles de similitud: SM=0,68, J=0,39 y D=0,56. Determinándose el coeficiente de Simple Matching como el más idóneo para análisis de variabilidad genética con marcadores dominantes como AFLP en L. mutabilis Sweet.

Palabras clave: Simple Matching; Jaccard; Dice; Lupinus mutabilis; AFLP.

ABSTRACT

Three similarity coefficients were used: Simple Matching (SM), Jaccard (J) and Dice (D) to analyze genetic variability through the use of AFLP molecular markers in 48 Lupinus mutabilis Sweet accessions, 26 from the Department of Cusco and 22 from different departments and countries (Ecuador and Bolivia). From similarity matrices, dendrograms were generated with each coefficient, using the UPGMA method through the NTSYSpc software version 2.01, analyzing and comparing each other, obtaining a coefficient of co-phenetic correlation (r): SM = 0.68674, J = 0.79116 and D = 0.79332; a Consensus Index (Clc): SM – J = 0.52, SM – D = 0.52 and J – D = 0.93; and levels of similarity: SM = 0.68, J = 0.39 and D = 0.56. The Simple Matching coefficient was determined as the most suitable for analysis of genetic variability with dominant markers such as AFLP in L. mutabilis Sweet.

Keywords: Simple Matching; Jaccard; Dice; Lupinus mutabilis; AFLP.

Recibido: 10-04-2021.

Aceptado: 05-09-2021.

El género Lupinus incluye casi 300 especies, pero solo cuatro juegan un papel importante en la agricultura: L. albus, L. angustifolius, L. luteus y L. mutabilis (Gresta et al., 2017) (Gulisano et al., 2019). La especie L. mutabilis Sweet (tarwi), de contenido elevado de proteínas y aceites (Atchison, 2016), llega a contener un 51% de proteína (Quiñones, 2019) y por encima del 20% de ácidos grasos en semillas (Galek, 2017). Este posee la mayor calidad de grano de todos los altramuces cultivados y está adaptada a la agricultura de bajos insumos en climas templados. La combinación de estas características convierte a L. mutabilis en una alternativa potencialmente superior a las fuentes actuales de proteínas y aceites vegetales (Gulisano et al., 2019); así también, el Tarwi exhibe rasgos clave de domesticación, que incluyen vainas indehiscentes y semillas con tegumento permeable, que representan un cultivo de importancia local en varias áreas andinas (Guilengue et al., 2020). No obstante, diversos factores sociales desprestigia-ron su consumo, limitando su estudio (Martínez et al., 2015; Martínez, 2015), siendo pertinente desarrollar investigación de la variabilidad genética de esta especie, puesto que existe pocos estudios usando marcadores moleculares (Chirinos-Arias, 2015), en tanto, como mencionan Guillengue et al. (2020), el establecimiento de programas de mejoramiento y conservación, e incluso la introducción de este cultivo, depende en gran parte, del profundo conocimiento de la variabilidad genética intraespecífica de las colecciones.

Uno de los enfoques que se usa en estudios de diversidad genética se basa en comparaciones de genotipos individuales dentro y entre las poblaciones (Kosman & Leonard, 2005). El primer paso en este proceso consiste en elegir las unidades u objetos a clasificar, es decir las OTU (Operational Taxonomy Unit) (Sokal & Sneath, 1963). Según Crisci & López (1983), los procesos clasificatorios se basan en las diferencias de los objetos (caracteres) y los valores que ese carácter puede presentar, se les considera estados. En el presente estudio se utilizaron marcadores moleculares AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphisms), marcadores dominantes (Vos et al., 1995) ventajosos para el estudio de cada sujeto y de la población (Suárez-Contreras, 2018), con los que se obtiene un perfil molecular característico independiente de las condiciones ambientales y del crecimiento de la planta (Remón-Gamboa & Peña-Rojas, 2018), los datos generados son de tipo doble estado: presencia-ausencia (Moscoe & Emshwiller, 2015), pudiendo generar muchos marcadores de ADN aleatorios en una sola amplificación por PCR.

Reif et al. (2005) sugieren el término "alelo informativo" si las frecuencias alélicas se pueden determinar a partir de los datos de marcadores moleculares, y el término "alelo no informativo" si no pueden hacerlo. Entonces, cuando los datos generados por los marcadores moleculares son "alelos no informativos", como es el caso de los marcadores dominantes, las estimaciones de los coeficientes entre OTU basándose en la ausencia o presencia de bandas observadas, se pueden calcular por uno de los tres coeficientes de similaridad:

1) Simple matching: SSM

2) Jaccard: SJ

3) Dice: SD

Se denota: = número de posiciones con bandas compartidas para los individuos (1-1); = número de posiciones en las que el individuo i₁ tiene una banda, pero i₂ no lo hace (1-0); = número de posiciones en las que el individuo i₂ tiene una banda, pero i₁ no lo hace (0-1); y = número de posiciones con bandas ausentes compartidas para los individuos (0-0) (Sokal & Sneath, 1973), siendo el coeficiente SSM el único de los tres que considera bandas ausentes compartidas. El coeficiente de Jaccard creado para análisis en fitología (Jaccard, 1912) funciona bien con datos binarios y así como el coeficiente Dice mide la similitud directamente, esto lo hace fácil de implementar y rápido en el cálculo (Bero et al., 2017). Muchas investigaciones utilizan el coeficiente de Jaccard para medir similitudes en varios campos (Duarte et al., 1999; Loh et al., 2016).

Según Duarte et al. (1999) los resultados de la agrupación pueden estar influenciados por la elección del coeficiente de similitud y muchas veces los autores no justifican la elección del o los coefi-cientes utilizados, razón que evidencia la necesidad de que los mismos deben ser más estudiados, de modo que sea empleado el más eficiente depen-diendo de la situación. En el presente trabajo se comparan los coeficientes de similaridad buscando determinar el más idóneo acorde a la especie en estudio y a los marcadores moleculares utilizados.

Material vegetal. En el laboratorio de Biología Molecular de la Escuela Profesional de Biología, Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco (UNSAAC), cuyas coordenadas geográficas son 13°31′18″ latitud sur y 71°57′31″ longitud oeste, con temperatura controlada que osciló entre 8 °C y 18 °C; con humedad relativa entre 52% y 60%; se sembraron semillas de 48 accesiones de L. mutabilis Sweet proporcionadas por el Banco de Germoplasma de la Granja K’ayra de la UNSAAC, a partir de las que se extrajo el ADN a ser analizado.

Marcadores AFLP. En el Área de Biología Molecular del Instituto de Biotecnología (IBT) de la Universidad Nacional Agraria La Molina se desarrolló el análisis con marcadores AFLP siguiendo el protocolo de Vos et al. (1995). Amplificados los fragmentos de ADN, fueron separados vía electroforesis en geles de poliacrilamida y luego teñidos con Nitrato de Plata. La lectura y enumeración de bandas tomó en cuenta aquellas con mejor resolución.

Análisis de similitud genética: Los datos binarios del conteo de los fragmentos amplificados se registraron en una hoja de cálculo Microsoft Excel 2015. Cada banda o fragmento de ADN, generado por cada combinación de iniciadores, se consideró como un locus individual con dos posibles alelos: presencia de banda, se le asignó el número 1; ausencia de banda, se le asignó el valor 0. A las bandas de presencia dudosa se les asigno el número 9. La similitud genética se calculó utilizando los coeficientes de similitud Simple Matching (SM), Jaccard (J) y Dice (D), obteniéndose tres matrices de similitud. Se utilizó el software NTSYSpc versión 2.01 (Applie Biostatistics Inc., Setauket, Nueva York, EE.UU.).

La comparación de los coeficientes de similitud se realizó a partir del análisis de las representaciones gráficas (dendrogramas), de la medición de la distorsión y del índice de consenso:

Representación gráfica: Obtenida la matriz de similitud, mediante la técnica de ligamiento “media aritmética no ponderada” (UPGMA, “unweihted pair-group method using arithmetic averages”) se elaboró el dendrograma donde las OTU son incorporadas a núcleos o grupos ya formados tomando en cuenta que el valor de la similitud entre las OTU candidatas a incorporarse y el núcleo o grupo es igual a una similitud promedio resultante de los valores de similitud entre la candidata y cada uno de los integrantes del núcleo o grupo. Si la candidata a incorporarse es un núcleo o grupo, el valor de similitud será el promedio de los valores de similitud entre los pares posibles de OTU provenientes de cada núcleo o grupo (González-Andrés & Pita, 2001); dentro del módulo SAHN del programa NTSYS-pc versión 2.01.

Medición de la distorsión: Se utilizó el coeficiente de correlación cofenética (r), establecido por Sokal & Rohlf (1962), para medir el grado en que el fenograma representa los valores de la matriz de similitud, construyendo, a partir de los valores del fenograma, una matriz cofenética de similitud, cuyos elementos se definen como aquellos que determina la proximidad entre los elementos i y j cuando estos se unen en un mismo clúster. Este coeficiente es la correlación entre los elementos de la matriz de similitud y la matriz cofenética.

Índice de consenso: Se utilizó el índice de consenso Clc para la comparación de los dendrogramas obtenidos, proveyendo una estimación relativa de la similitud entre los mismos (Rohlf, 1997). Se obtuvo dividiendo el número de ramificaciones en común en los dendrogramas, entre el número máximo posible de ramificaciones. El valor del índice varía desde 0 donde no existe ningún consenso hasta 1 donde los dendrogramas son idénticos (Alagón & Rosas, 2008).

Iniciadores AFLP

Cuatro combinaciones de iniciadores fueron aplicadas en toda la población, generando un total de 198 bandas, de las cuales 66 fueron polimórficas, representando el 33,33%. (Tabla 1). La combinación de iniciadores con la que se obtuvo mayor número de bandas fue [E33/M50] con 58 bandas, además, también generó el mayor número de bandas polimórficas por combinación, que fueron 21 bandas, representando el 36,20%; no obstante, la combinación con la que se obtuvo mayor porcentaje de bandas polimórficas fue [E33/M31] (38,46%).

La combinación de iniciadores con la que se obtuvo mayor número de bandas fue [E33/M50] con 58 bandas, además, también generó el mayor número de bandas polimórficas por combinación, que fueron 21 bandas, representando el 36,20%; no obstante, la combinación con la que se obtuvo mayor porcentaje de bandas polimórficas fue [E33/M31] (38,46%).

Análisis de similitud genética

La representación del agrupamiento de las 48 entradas de tarwi según los coeficientes de similitud Simple Matching (SM) (Figura 1), Jaccard (Figura 2) y Dice (Figura 3), demuestran diferentes grados de similitud.

Dendrograma empleando el coeficiente de similitud de Simple Matching

El coeficiente de Simple Matching evidencia la separación de las 48 accesiones en dos grupos (A y B) a un nivel de similitud de 0,68. (Figura 1). El grupo A agrupa 43 accesiones, encontrándose 5 subgrupos dentro de este grupo (i, ii, iii, iv, v) las mismas q se separan a un nivel de similitud de 0,76. El grupo B agrupa las 5 accesiones restantes, dividiéndose a un nivel de similitud de 0,71.

Tabla 1

Patrón de Fragmentos Polimórficos y Valores del Índice de Contenido Polimórfico (PIC) para las cuatro combinaciones de iniciadores elegidas

Iniciadores EcoRI	Iniciadores MseI	Código	Fragmentos Polimórficos	N° Total de Fragmentos	% Polimorfismo
EcoRI – AAG	MseI – CAT	E33/M50	21	58	36,20
EcoRI – ACA	MseI – CAC	E35/M48	13	48	27,08
EcoRI – AAG	MseI – AAA	E33/M31	15	39	38,46
EcoRI – AGG	MseI – CAC	E41/M48	17	53	32,08
Promedio			16,5	49,5	33,46

Figura 1. Dendrograma obtenido mediante el coeficiente de Simple Matching.

Figura 2. Dendrograma obtenido mediante el coeficiente de Jaccard.

Figura 3. Dendrograma obtenido mediante el coeficiente de Dice.

Dendrograma empleando el coeficiente de similitud de Jaccard

La inspección visual del dendrograma del coeficiente de similitud de Jaccard evidencia una separación en dos grupos A y B a un nivel de similitud de 0,57. Además, se observan 4 grupos independientes (c, d, e, f) (Figura 2). En el grupo A se agrupan 4 accesiones, las mismas que con el coeficiente de Simple Matrching se agrupan en el subgrupo i del grupo A. En el grupo B se agrupan 38 accesiones en 5 subgrupos (i, ii, iii, iv, v). En los grupos independientes c y e encontramos una sola accesión, mientras que en d y f se agrupan dos accesiones.

Dendrograma empleando el coeficiente de similitud de Dice

Este coeficiente nos muestra las accesiones agrupadas en dos grupos principales A y B y cuatro grupos independientes c, d, e y f (Figura 3). Los grupos A y B se separan a un nivel de similitud de 0,71. El grupo A agrupa las mismas 4 accesiones que el grupo A del coeficiente de Jaccard. El grupo B agrupa las 38 accesiones que también agrupa el grupo B del dendrograma del coeficiente de Jaccard. La distribución de los grupos indepen-dientes c, d, e y f es idéntica a la observada mediante el coeficiente de Jaccard, diferenciándose en el nivel de similitud.

Coeficiente de correlación cofenética (r)

Generadas las matrices de similitud originales, fueron evaluadas independientemente para obtener las matrices cofenéticas correspondientes, las mismas que resultaron de un análisis cofenético partiendo del dendrograma generado con cada coeficiente de similitud (Tabla 2).

La concordancia entre la matriz de similitud original y la matriz cofenética (obtenida a partir del dendrograma), sirvió para evaluar la existencia de diferencias significativas en la correlación de las mismas, dando como resultado valores “r” del coeficiente de correlación cofenética que permitieron determinar el coeficiente de similitud con menor distorsión en su representación a través de su respectivo dendrograma.

Según Sokal & Sneath (1973) los valores “r” del coeficiente cofenético, oscilan entre 0,6 y 0,95 entendiéndose los más altos valores como indicadores de una buena correspondencia entre la matriz original y su representación a través de un dendrograma. Sin embargo, valores bajos de esta correlación no necesariamente indican que el dendrograma obtenido no sea de utilidad, sino que solamente estaría indicando algún tipo de distorsión al momento de obtener el dendrograma (Rohlf, 1982).

En el presente estudio, el agrupamiento mediante el coeficiente de Simple Matching demostró el menor grado de correspondencia (r = 0,68) entre los tres coeficientes de similitud utilizados, en tanto, los coeficientes de Jaccard y Dice arrojaron valores de 0,79116 y 0,79332 respectivamente. Esto nos indica una menor distorsión en las relaciones originales existentes entre los elementos en estudio mediante la representación de la matriz de similitud de Dice.

Índice de consenso (CIc)

El Índice de Consenso (CIc) indica la similitud entre los dendrogramas obtenidos a través de los coeficientes de similitud Simple Matching, Jaccard y Dice (Tabla 2), los que se usaron para agrupar las 48 accesiones de L. mutabilis Sweet usadas en el presente estudio.

Según Meyer et al. (2004) y Dalirsefat et al. (2009) la comparación a través del índice de consenso (CIc) de los dendrogramas obtenidos, permite el refinamiento de aquello apreciado mediante la inspección visual. Este índice cuya amplitud va de 0 a 1, considera idénticos dos dendrogramas cuando el valor calculado es uno. Como se muestra en la tabla 2, el índice de consenso entre los coeficientes de Jaccard y Dice (0,93) es muy cercano a uno, evidenciándose en la idéntica distribución de los grupos, variando solo el nivel de similitud. Los valores CIc para SM – J y SM – D (0,52), demuestran una baja similaridad entre esos dendrogramas, evidenciado en la diferente distribución de los grupos, así como en los niveles de similitud.

La similar apariencia, basada en los dendrogramas, de los coeficientes Jaccard y Dice se puede simplificar en las propiedades de estos. Se distinguen por la forma como estos emplean la matriz de datos original (1 = presencia de marcador AFLP y 0 = ausencia) en la estimación de similitud. Es así que Jaccard y Dice son equivalentes, excepto que Dice le brinda doble valor a las co-ocurrencias positivas, mientras que Simple Matching es el único que toma en cuenta las co-ocurrencias negativas (Duarte et al., 1999).

Elección del coeficiente de similitud

La selección del coeficiente de similitud que se tomó en cuenta para los posteriores análisis de agrupamientos estuvo en función de las propiedades intrínsecas de cada coeficiente, del nivel de similitud obtenido con cada coeficiente (Tabla 2), de la ploidía del organismo analizado que es la especie Lupinus mutabilis Sweet y de la base teórica correspondiente al marcador molecular utilizado, en este caso AFLP.

En la Tabla 2 se observa que el coeficiente SM es el que mayor nivel de similitud evidencia (0,68), corroborando que, para un conjunto dado de datos, los valores correspondientes de similitud de Jaccard son siempre menores que los de la similitud de Dice y los de Simple Matchig. Por otro lado, los valores de la similitud de Dice pueden ser mayores o menores que los valores correspondientes al coeficiente SM en función de si el número de posiciones con bandas compartidas es mayor o menor que el número de posiciones con ausencia compartida de bandas, respectivamente (Kosman & Leonard, 2005); esto es debido a que el coeficiente de Dice brinda doble valor a las bandas compartidas (1–1), mientras que el coeficiente SM considera por igual las dobles ausencias (0-0). Siendo el nivel de similitud de Dice (0,56) que es menor que el de SM (0,68), se infiere que existen mayores ausencias compartidas de bandas, posiblemente debido a las combinaciones de cebadores utilizadas, ya que, tanto EcoRI como MseI contenían +3 nucleótidos, haciéndose más específica la amplificación, en comparación con el análisis de Jimenez (2006) que utilizó EcoRI +2 y MseI + 3, obteniendo mediante el coeficiente de Dice un nivel de similitud que varió de entre 0,81 a 0,98; pues los cebadores con dos nucleótidos selectivos amplifican 1/256 de fragmentos de restricción y cebadores con tres amplifican 1/4096 de fragmentos (Weising et al., 2005).

Teniendo en cuenta que la agrupación y coordinación de los resultados pueden ser influenciadas por la elección del coeficiente (Duarte et al., 1999), estos coeficientes deben ser mejor entendidos. El coeficiente de similitud empleado debe reflejar con precisión nuestro mejor entendimiento del fenotipo observado, así como la base genética de los individuos estudiados. (Kosman & Leonard, 2005).

Reif et al. (2005) examinaron 10 coeficientes de similitud ampliamente utilizados en las evaluaciones de germoplasma, con especial énfasis en aplicaciones en bancos de cultivo de plantas y semillas. Sugieren el término "alelo informativo" si las frecuencias alélicas se pueden determinar a partir de los datos de marcadores moleculares, y el término "alelo no informativo" si no pueden hacerlo. Entonces, cuando los datos generados por los marcadores moleculares son "alelos no informativos", como es el caso de los marcadores dominantes, utilizándose AFLP’s en este estudio, las estimaciones de los coeficientes entre OTU se pueden calcular por uno de los tres coeficientes: Simple Matching, Jaccard y Dice, basándose en la ausencia o presencia de bandas observadas (Sneath & Sokal,1973). El argumento original para excluir las co-ocurrencias negativas (0-0) está basado en el uso de rasgos donde todos los grupos que fueron comparados incluyeron el estado 0 del rasgo. Por un enfoque conservador, la similaridad en las huellas de ADN es generalmente definida como la fracción de bandas observadas que son compartidas por dos individuos. Para marcadores dominantes, como los AFLP, generalmente se asume que cada banda representa un diferente locus bi-alélico (Williams et al., 1990) y que la alternativa a una banda en la posición característica de ese locus en el gel, es la ausencia de una banda en cualquier parte del gel. Además, con estos marcadores, los individuos que son heterocigotos para una banda de ADN en una posición específica, no pueden distinguirse con certeza de los individuos que son heterocigotos para esa banda (Kosman & Leonard, 2005).

Según Kosman & Leonard (2005) el mayor problema en la elección del coeficiente de similitud para análisis de datos obtenidos con marcadores moleculares dominantes, es el tratamiento de la ausencia de una banda compartida en alguna posición por dos individuos. Un argumento común contra el uso del coeficiente SM para datos de marcadores dominantes es que la ausencia de una banda compartida por dos individuos no debe considerarse como una prueba de similitud entre ellos. El fundamento común de este argumento es que la ausencia de un rasgo puede ser consecuencia de muchas causas diferentes, y por lo tanto la ausencia de cualquier rasgo compartido no es una buena prueba de similitud genética. Este argumento, sin embargo, ignora el alto grado de identidad de secuencia de ADN entre los miembros de una misma especie. Es así, que siendo los individuos aquí estudiados miembros de una misma especie (L. mutabilis Sweet), si dos de ellos presentasen una banda en una determinada posición, se asume que son idénticos en esa región, aparte de la secuencia de nucleótidos correspondientes a los cebadores utilizados en la amplificación. Por otro lado, ante la ausencia de banda en la misma posición por parte de otros individuos, podemos inferir que tienen una altísima probabilidad de poseer una secuencia idéntica en esa región de ADN, muy aparte de los pares de bases de nucleótidos pertenecientes a los cebadores, inclusive si provienen de regiones geográficamente separadas.

Un enfoque más conservador sería suponer, como el coeficiente SM hace, que la falta de una banda compartida por dos miembros de la misma especie, es una buena evidencia de que los dos son genéticamente similares en esa región (Kosman & Leonard, 2005); en ese entender, se ha considerado al igual que Hallden et al. (1994) y Beharav et al. (2010) que el coeficiente de SM ha de ser la medida más apropiada de similitud cuando se consideran los taxones estrechamente relacionados.

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Coeficiente de similitud	Coeficiente de correlación cofenética “r”	Nivel de similitud	Índice de consenso
Simple Matching (SM)	r = 0,68674	0,68	SM – J	0,52
Jaccard (J)	r = 0,79116	0,39	SM – D	0,52
Dice (D)	r = 0,79332	0,56	J - D	0,93