Abejas nativas sin aguijón en Tumbes, Perú:  Caracterización genómica y comunidad bacteriana

Native stingless bees in Tumbes, Peru: Genomic characterization and bacterial community

Milton Valladolid R.^1, *; Henry W. Chapoñan D.^1, *; Ramón García-Seminario¹; Pedro G. Labán L.¹; Néstor

Díaz C.¹; Carlos A. Deza N.¹; Miguel A. Garrido R.¹; Dicson Sánchez A. ²; Jorge Zapata O. ²; Eric Louis Mialhe²

1 Universidad Nacional de Tumbes. Perú.

2 INCA BIOTEC S.A.C, Tumbes, Perú.

*Autor corresponsal: mvalla01@gmail.com  (M. Valladolid R.); echai5001@gmail.com (H. Chapoñan D.)

ID ORCID de los autores

M. Valladolid R.: http://orcid.org/0000-0002-0526-0544                     H. W. Chapoñan D.: http://orcid.org/0000-0002-4049-3466

R. García-Seminario: http://orcid.org/0000-0003-0756-0935             Pedro G. Labán L.: http://orcid.org/0000-0002-8107-1534

N. Díaz C.: http://orcid.org/0000-0003-3808-5954 C. A. Deza N.: http://orcid.org/0000-0002-3324-3741

M. A. Garrido R.: http://orcid.org/0000-0002-8542-9353 D. Sánchez A.: http://orcid.org/0000-0001-9397-9024  

J. Zapata O.: http://orcid.org/0000-0002-4560-8234                              E. Louis Mialhe: http://orcid.org/0000-0002-7952-6907

RESUMEN

“Abejas nativas sin aguijón” se encuentran en bosques secos de la Reserva de Biosfera del Noroeste Amotapes Manglares, Tumbes, Perú, y poblaciones rurales cercanas. Estas abejas cumplen un rol importante como polinizadoras de cultivos agrícolas, forestales y como proveedoras de miel y polen", siendo Melipona mimética la especie más importante. Los objetivos del estudio fueron: la identificación molecular usando tres locis genéticos distintos (Citocromo c oxidasa, 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA), la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y análisis bioinformático, identificándose a los géneros: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp. Y haciendo uso de Metagenómica y secuencias cortas del gen 16s DNAr, comprobado en NCBI, se encontró a especies bacterianas en: huevos 139, larvas 31, pupas 154 y adultos 39, siendo las más importantes Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici, y a través de técnicas dependiente e independiente de medios de cultivo a: Bacillus subtilis subsp subtilis en larva, Paenibacillus xylanilyticus en pupa y adulto: Humibacter sp., Acinetobacter sp., Acinetobacter nectaris y Fructobacillus sp. La identificación genómica y comunidad bacteriana es relevante, por tratarse del primer estudio de estas especies en Perú.

Palabras clave: ADNr; PCR; microbiota; Melipona mimética; polinizadores

ABSTRACT

"Native stingless bees" are found in dry forests of the Northwest Amotapes Biosphere Reserve Mangroves, Tumbes, Peru, and nearby rural populations. These bees play an important role as pollinators of agricultural and forest crops and as suppliers of honey and pollen", Melipona mimética being the most important species. The objectives of the study were: molecular identification using three different genetic loci (Cytochrome c oxidase, 28S ribosomal RNA and 16S rRNA gene), Polymerase Chain Reaction (PCR) and bioinformatic analysis, identifying with the genres: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp.  And making use of Metagenomics and Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici,short sequences of the 16s DNAr gene, verified in NCBI, bacterial species were found: in eggs 139, larvae 31, pupae 154 and adults 39, being the most important Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici and through media-dependent and media-independent techniques to: Bacillus subtilis subsp subtilis in larva, Paenibacillus xylanilyticus in pupa and adult: Humibacter sp., Acinetobacter sp., Acinetobacter nectaris and Fructobacillus sp. The genomic identification and bacterial community are relevant, as it is the first study of these species in Peru.

Keywords: rDNA; PCR; microbiota; Melipona mimética; pollinators.

Recibido: 11-02-2022.

Aceptado: 03-06-2022.

INTRODUCCIÓN

Las “abejas sin aguijón” constituyen un grupo de abejas melíferas que se encuentran localizadas en los diversos ecosistemas del mundo. La mayor diversidad de especies estimadas se distribuye en el Neotrópico con 400 especies y 33 géneros aproximadamente desde México hasta Argentina (Nates-Parra et al., 2013; Vit et al., 2015; Arnold, et al., 2018), En Ecuador se han identificado las especies; Scaptotrigona ederi, Melipona mimética, M. indecisa, Paratrigona aff. y Nannotrigona cf., basándose en análisis taxonómicos y morfométricos (Vit et al., 2018).

Las Meliponas en la región de Tumbes, se encuentran dispersas en el bosque seco de la zona Reserva de Biosfera del Noroeste Amotapes-Manglares (RBNAM), así como en las poblaciones rurales cercanas a la reserva. Siendo muy apreciadas por las propiedades terapéuticas de su miel, sin embargo, su situación es muy delicada, debido a la sobreexplotación por parte de la población rural, por lo que debería catalogarse en la lista de especies en estado crítico o vulnerable. En ese contexto, surge la necesidad de realizar estudios concernientes a su identificación, biología y conservación.

Los pocos estudios de identificación que se han realizado en el Perú a nivel taxonómico de distintas especies de abejas sin aguijón, fueron realizados de características morfológicas por; (Elizalde et al., 2016; Rasmussen et al., 2016; Vásquez-García, et al., 2021), El uso de herramientas moleculares permite caracterizar especies de distintos organismos y sustancias activas de una manera rápida y eficaz (Hebert et al., 2010)

Estudios recientes de diversidad de microbiota intestinal para ser utilizados como estrategias de control, pese a que es un sistema complejo por la relación entre hongos, bacterias y el huésped (en los intestinos de las abejas), (Chanbusarakum et al., 2008). Se comprobó un crecimiento ilimitado de baterías intestinales en la alimentación de larvas, llegando al 100 % de infección de bacterias, disminuyendo en prepupa, pupa y, aumentando en adulto (Paludo et al., 2019)

La literatura no reporta estudios de identificación de abejas y su microbiota a nivel molecular en el Perú, por lo que esta investigación muestra los primeros antecedentes de una secuencia genómica y los microorganismos bacterianos encontrados a nivel de intestino de estos insectos para programas de desarrollo de una meliponicultura y apicultura sostenible.

MATERIAL Y MÉTODOS

Zonas de ejecución y colección de material biológico 

Las evaluaciones se realizaron en las poblaciones rurales cercanas a Reserva de Biosfera del Noroeste de Amotapes-Manglares (RBNAM), las muestras fueron obtenidas de las localidades de Rica playa, Pampas de Hospital, Cabuyal, La Angostura, Papayal, Isla Noblecilla y La Totora, la colecta de abejas se realizó haciendo uso de una red entomológica donde estas realizaban el pecoreo sobre flores y cercanas a la entrada de la colonia (piquera), así como directamente de las cajas racionales de pequeños meliponarios, siendo depositadas en tubos falcón de 50 ml conteniendo buffer twin al 2%, siguiendo protocolos establecidos y luego llevadas, en Criobox con GelPack al Laboratorio de Biología Molecular de la empresa INCA’BIOTEC S.A.C.

Identificación de Melipona mimética

Las muestras se desinfectaron siguiendo el protocolo, el proceso se inició seccionándole la pata trasera para abejas grande, patas y tórax para medianas y cuerpo entero para especímenes pequeños, el procedimiento utilizado fue una modificación al método del acetato de potasio, para las reacciones de PCR se utilizaron primers del gen COI, LCO1490 y HCO2198, del (PM 7/129 (1) DNA., 2016), del gen 28S los primers 28s D2F y 28s D3R, así mismo del gen 16S con los primers 16SWb y 16SWa para preparar el mix usado en PCR con un volumen final de 24 μL, que contenían 19,7 μL de agua libre de nucleasas, 2,5 μL de buffer 10X, 0.5 μL de dNTP’s 10mM, 0,6 μL de cada primers: Forward 15μM, Reverse15μM y 0,1 μL de Taq DNA polymerase 5U/μL; agregándoseles a cada una 1 μL de ADN genómico (Josefsen et al., 2015).

Se utilizó un termociclador TurboCycler 2 de Blue-Ray Biotech para la amplificación, realizándose un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg, con un alineamiento a 50 °C por 45 seg, y dos extensiones a 72 °C, una por 1 min y la final por 7 min.

Los productos de PCR se tiñeron con 2 µl de azul de bromofenol + 8 µl del amplicón, estos fueron migrados en gel de agarosa al 1% a 90 Voltios por 25 min y posteriormente se visualizaron bajo luz UV. Posteriormente, se visualizaron en un transluminador. UV TMW-20

Los amplicones obtenidos en la PCR, fueron secuenciados en la empresa Magrogen-EE.UU. Las secuencias obtenidas, fueron comparadas con la base de datos de GenBank del NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) para determinar mayor porcentaje de homología.

Identificación de comunidad bacteriana

Se colectaron muestras de los estados de desarrollo: huevo, larva pupa y adulto, de M. mimética de un meliponario ubicado en el distrito de Pampas de Hospital, región Tumbes, se utilizaron bolsas ziploc para llevarlas al laboratorio, en discos de cría conteniendo tubos eppendorf.

Microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo.

Las muestras biológicas fueron congeladas y depositadas por separado en tubos eppendorf de 2 ml, posteriormente fueron llevadas a cámara con UV donde se desinfectaron superficialmente adicio-nando etanol al 70 % por 3 min, luego se eliminó y se adicionó NaClO al 1% por 30 seg, se les enjuago 3 veces con agua destilada y esterilizada, posterior-mente las muestras fueron maceradas, utilizándose una parte para la extracción de ADN (meta-genómica) (Díaz et al., 2018).

Microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo

Parte de las muestras maceradas, fueron agregadas por separado a 1 ml de agua destilada, se homogenizo y se tomaron 20 µl de las muestras para ser esparcidas en cajas petri conteniendo el medio de cultivo TSA, las cuales fueron incubadas por 24 horas, posteriormente purificadas y cultivadas en caldo LB por 24 horas (Díaz et al., 2018). 

Extracción de ADN de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes y dependientes del medio de cultivo

Para extraer el ADN metagenómico de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo, se tomó una parte de cada muestra macerada y se procedió con la aplicación del protocolo recomendado por el kit comercial PowerSoil® DNA Isolation Kit, (Josefsen et al. 2015). Así mismo para la microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo, se usaron cepas bacterianas purificadas las cuales fueron centrifugadas a 13,000 rpm, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento fue resuspendido en 1 ml de solución tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA). Las bacterias fueron sometidas a una locis celular por adición de 30 µl de SDS (10%) y 3 µl de proteinasa K (37 °C, 1 hora), se añadió 100 µl de NaCl (5M) y 80 µl de CTAB/NaCl (previamente calentado a 65 °C) y se incubaron a 65 °C por 10 min. Posteriormente, se adicionó cloroformo/alcohol isoamil (24:1) y tras centrifugarse a 13,000 rpm por 5 min, se añadió 0,6 ml de isopropanol, volviéndose a centrifugar a 1,200 rpm por 5 min, se descartó al sobrenadante y al precipitado se le adicionó 1ml de etanol frío, y nuevamente se centrifugó a 12,000 rpm 5 min, se eliminó el etanol mediante secado a temperatura ambiente por 5 min, y se obtuvo los ácidos nucleicos a los cuales se les adicionaron 30 𝑢l de tampón TE y 1 µl de solución de RNAsa a 37 °C  por 1 hora para eliminar el ARNs y obtener el ADN puro (Díaz et al., 2018 y Ribière et al., 2019).

Amplificación del gen del ADNr 16S

Se utilizaron los primers universales 27-f Forward 5'AGAGTTTGATCMTGGCTC- 3' y 1492-r Reverse 5' – TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3' (Belkaid et al. 2017), para lo cual se utilizó un mix de reacción para la amplificación del gen del ADNr 16S compuesto de Buffer Taq 10X 2,5µL, MgCl₂ 25mM 2,5µL, dNTP’s 10mM 0,5µL, Taq Polimerase 5U/ µL 0,1µL, 16s ARNr F 0,6, 16s ARNr R 0,6, Agua ultra pura 16,2µL, ADN 3µL, con un volumen final 25µL. La PCR con un programa de desnaturalización inicial 94 °C en 5 min 1 ciclo, y otro por 30 seg, Hibridación 49 °C en 60 seg, Elongación de 72°C por 1 min con 35 ciclos, y la final 72 °C por 4 min por 1 ciclo y a temperatura final de conservación de 4 °C (Díaz et al. 2018).

Obtención de la secuencia parcial del gen del ADN ribosómico 16S

La secuenciación nucleotídica se realizó empleando primers internos 16S ADNr 518F y 16S ADNr 800R, las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas con el software BLAST usando la base de datos del 16S ADNr del GEN BANK y el programa MEGA 6. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information – USA).       

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La identificación molecular de las “abejas sin aguijón”, fue mediante tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA, utilizados en la identificaciones de hymenópteros (González et al., 2019; Engel, et al., 2020) y para la identificación  de los géneros: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp.,  Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp.,  Trigona sp. y Trigonisca sp., mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el uso del análisis bioinformático. Resultados concordantes con los reportados por (Engel et al., 2017; Rasmussen et al., 2017; Delgado et al., 2019; Álvarez, et al., 2020; Janio et al., 2020; Pazmiño-Palomino et al., 2021).

En la comunidad bacteriana

a. Microbiota intestinal independiente de medio de cultivo

Mediante metagenómica se identificó 85 géneros de bacterias que conforman la microbiota interna del estado de huevo en M. mimetica (Tabla 1), siendo Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11.039% y Pseudomonas sp., 8,547%, siendo los de mayor porcentaje los 5 primeros de la tabla; en el estado de larva fueron identificados 14 géneros (Tabla 2), de los cuales Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%, los porcentajes más representativos; en pupa 79 géneros (Tabla 3), Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,42% y Brevundimonas sp. 5,402%, siendo los 8 primeros los de mayor porcentaje; para estado adulto (obrera) (Tabla 4), se identificó 53 géneros bacterianos, siendo los 3 primeros los de mayor porcentaje Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%. Además, se identificó 6 géneros de bacterias presentes en la microbiota de los estados de desarrollo (Tabla 5), siendo Lactobacillus sp., el de mayor porcentaje, resultados que concuerdan con los reportados por (Dürre et al., 2014; Forsgren et al., 2017; Belkaid et al., 2017; Ngalimat et al., 2019; Ribière et al., 2019; Romero et al., 2019; Rouzé et al., 2019).

Tabla 1

Géneros de bacterias identificados en la microbiota interna del estado de huevo de M. mimetica

N°	Género	Porcentaje	N°	Género	Porcentaje
1	Acinetobacter sp.	17,663	44	Haliscomenobacter sp.	0,010
2	Lactobacillus sp.	13,411	45	Polaribacter sp.	0,010
3	Alishewanella sp.	11,350	46	Thalassomonas sp.	0,010
4	Shewanella sp.	11,039	47	Roseovarius sp.	0,010
5	Pseudomonas sp.	8,547	48	Thalassobius sp.	0,010
6	Cloacibacterium sp.	3,705	49	Bdellovibrio sp.	0,006
7	Kaistobacter sp.	3,497	50	Clostridium sp.	0,006
8	Intestinibacter sp.	3,381	51	Demequina sp.	0,006
9	Corynebacterium sp.	2,960	52	Escherichia sp.	0,006
10	Finegoldia sp.	2,707	53	Granulosicoccus sp.	0,006
11	Streptococcus sp.	2,687	54	Lewinella sp.	0,006
12	Ruminococcus sp.	2,498	55	Sagittula sp.	0,006
13	Paracoccus sp.	2,476	56	Spongiimonas sp.	0.006
14	Bacillus sp.	2,293	57	Verrucomicrobium sp.	0,006
15	Aliihoeflea sp.	2,090	58	Agarivorans sp.	0,003
16	Brevundimonas sp.	1,865	59	Alkaliphilus sp.	0,003
17	Peptoniphilus sp.	1,438	60	Bergeyella sp.	0,003
18	Lysobacter sp.	1,243	61	Chloroflexus sp.	0,003
19	Rhodobacter sp.	1,072	62	Citreicella sp.	0,003
20	Pantoea sp.	0,857	63	Coxiella sp.	0,003
21	Sphaerobacter sp.	0,822	64	Dechloromarinus sp.	0,003
22	Rhodovulum sp.	0,482	65	Desulfuromusa sp.	0.003
23	Actinotalea sp.	0,462	66	Donghicola sp.	0,003
24	Thiovirga sp.	0,231	67	Dyella sp.	0,003
25	Empedobacter sp.	0,228	68	Enterococcus sp.	0,003
26	Pediococcus sp.	0,128	69	Flexibacter sp.	0,003
27	Roseobacter sp.	0,125	70	Haliea sp.	0,003
28	Candidatus sp.	0,096	71	Haloferula sp.	0,003
29	Helicobacter sp.	0,058	72	Holospora sp.	0,003
30	Spongiibacter sp.	0,058	73	Imtechella sp.	0,003
31	Vibrio sp.	0,045	74	Jannaschia sp.	0.003
32	Cronobacter sp.	0,042	75	Marivita sp.	0,003
33	Kwoniella sp.	0,039	76	Mycoplasma sp.	0,003
34	Pedobacter sp.	0,032	77	Oleispira sp.	0,003
35	Raoultella sp.	0,029	78	Oligoflexus sp.	0,003
36	Flavobacterium sp.	0,029	79	Owenweeksia sp.	0,003
37	Olleya sp.	0,026	80	Pinguiococcus sp.	0,003
38	Tenacibaculum sp.	0,026	81	Pirellula sp.	0,003
39	Phaeobacter sp.	0,016	82	Synechococcus sp.	0,003
40	Rubritalea sp.	0,016	83	Terasakiella sp.	0,003
41	Ruegeria sp.	0,013	84	Tropicibacter sp.	0,003
42	Tabrizicola sp.	0,013	85	Ulvibacter sp.	0,003
43	Chlorella sp.	0,010

Tabla 2

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de larva de M. mimetica

N°	Genero	Porcentaje
1	Lactobacillus sp.	55,213
2	Coprobacillus sp.	25,489
3	Clostridium sp.	12,754
4	Pediococcus sp.	6,536
5	Stenotrophomonas sp.	0,003
6	Streptococcus sp.	0,001
7	Algoriphagus sp.	0,001
8	Barnesiella sp.	0,001
9	Candidatus stoquefichus sp.	0,001
10	Halospirulina sp.	0,001
11	Pseudomonas sp.	0,001
12	Stakelama sp.	0,001
13	Staphylococcus sp.	0,001
14	Acinetobacter sp.	0,001

Tabla 3

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de pupa de M. mimetica

N°	Genero	Porcentaje	N°	Genero	Porcentaje
1	Acinetobacter sp.	21,188	41	Pediococcus sp.	0,238
2	Staphylococcus sp.	8,118	42	Peptoniphilus sp.	0,226
3	Lactobacillus sp.	7,909	43	Oceanicola sp.	0,221
4	Planomicrobium sp.	6,531	44	Marmoricola sp.	0,198
5	Corynebacterium sp.	5,785	45	Jannaschia sp.	0,182
6	Micrococcus sp.	5,670	46	Pantoea sp.	0,165
7	Kocuria sp.	5,421	47	Shigella sp.	0,156
8	Brevundimonas sp.	5,402	48	Thermincola sp.	0,120
9	Pseudomonas sp.	3,907	49	Cronobacter sp.	0,084
10	Massilia sp.	2,375	50	Sulfurimonas sp.	0,081
11	Vibrio sp.	1,979	51	Raoultella sp.	0,073
12	Lentibacillus	1,836	52	Tropicibacter sp.	0,070
13	Streptomyces sp.	1,624	53	Ruegeria sp.	0,070
14	Loktanella sp.	1,557	54	Anoxybacillus sp.	0,067
15	Turicella sp.	1,478	55	Rothia sp.	0,061
16	Blastococcus sp.	1,428	56	Pectobacterium sp.	0.059
17	Tabrizicola sp.	1,425	57	Poseidonocella sp,	0,059
18	Comamonas sp.	1,333	58	Roseivivax sp.	0,048
19	Rhodovulum sp.	1,216	59	Serratia sp.	0,048
20	Streptococcus sp.	1,012	60	Roseobacter sp.	0,042
21	Cellulomonas sp.	0,794	61	Legionella sp.	0,031
22	Tropicimonas sp.	0,794	62	Enhydrobacter	0,022
23	Escherichia sp.	0,782	63	Candidatus saccharimonas	0,020
24	Eubacterium sp.	0,771	64	Planococcus sp.	0,020
25	Halospirulina sp.	0,721	65	Roseburia sp.	0,020
26	Paracoccus sp.	0,679	66	Lysinibacillus sp.	0,011
27	Anaerococcus sp.	0,668	67	Pseudoruegeria sp.	0,011
28	Enterobacter sp.	0,592	68	Aquabacterium sp.	0,008
29	Rhodobacter sp.	0,590	69	Hydrogenophaga sp.	0,008
30	Chryseobacterium sp.	0,539	70	Pelomonas sp.	0,006
31	Collinsella sp.	0,456	71	Phaeobacter sp.	0,006
32	Sphingobium sp.	0,422	72	Roseinatronobacter sp.	0,006
33	Prevotella sp.	0,411	73	Sagittula sp.	0,006
34	Flavobacterium sp.	0,377	74	Barnesiella sp.	0,003
35	Clostridium sp.	0,360	75	Bordetella sp.	0,003
36	Citrobacter sp.	0,313	76	Maritimibacter sp.	0,003
37	Bacillus sp.	0,296	77	Marivita sp.	0,003
38	Wohlfahrtiimonas sp.	0,277	78	Phyllobacterium sp.	0,003
39	Ornithinimicrobium sp.	0,260	79	Synechococcus sp.	0,003
40	Achromobacter sp.	0,249

Tabla 4

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de adulto (obrera) de M. mimetica

N°	Género	Porcentaje	N°	Género	Porcentaje
1	Lactobacillus sp.	91,809	28	Weissella sp.	0,001
2	Pediococcus sp.	5,101	29	Achromatium sp.	0,001
3	Halospirulina sp.	2,399	30	Algoriphagus sp.	0,001
4	Acetobacter sp.	0,422	31	Anoxybacillus sp.	0,001
5	Herbiconiux sp.	0,094	32	Arthrobacter sp.	0,001
6	Streptococcus sp.	0,060	33	Bradyrhizobium sp.	0,001
7	Bacillus sp.	0,024	34	Candidatus bacilloplasma	0,001
8	Staphylococcus sp.	0,011	35	Comamonas sp.	0,001
9	Acinetobacter sp.	0,009	36	Donghicola sp.	0,001
10	Azospirillum sp.	0,007	37	Enterobacter sp.	0,001
11	Clostridium sp.	0,006	38	Escherichia sp.	0,001
12	Barnesiella sp.	0,006	39	Eubacterium sp.	0,001
13	Enterococcus sp.	0,005	40	Granulosicoccus sp.	0,001
14	Asaia sp.	0,003	41	Helicobacter sp.	0,001
15	Candidatus odyssella	0,003	42	Hyphomicrobium sp.	0,001
16	Kocuria sp.	0,003	43	Lentibacillus sp.	0.001
17	Pseudomonas sp.	0,003	44	Lyticum sp.	0,001
18	Lachnoclostridium sp.	0,003	45	Massilia sp.	0,001
19	Brevundimonas sp.	0,002	46	Micrococcus sp.	0,001
20	Loktanella sp.	0,002	47	Paracoccus sp.	0,001
21	Pseudoalteromonas sp.	0,002	48	Photobacterium sp.	0,001
22	Turicella sp.	0,002	49	Planomicrobium sp.	0,001
23	Candidatus Stoquefichus	0,001	50	Shewanella sp.	0,001
24	Chryseobacterium sp.	0,001	51	Spongiibacter sp.	0,001
25	Conexibacter sp.	0,001	52	Tabrizicola sp.	0,001
26	Corynebacterium sp.	0,001	53	Vibrio sp.	0,001
27	Rubellimicrobium sp.	0,001

Tabla 5

Géneros de bacterias identificados en la microbiota de los estados de desarrollo de M. mimetica

Género	Huevo	Larva	Pupa	Adulto
Acinetobacter sp.	17,663	0,001	21,188	0,009
Clostridium sp.	0,006	12,754	0,360	0,006
Lactobacillus sp.	13,411	55,213	7,909	91,809
Pediococcus sp.	0,128	6,536	0,238	5,101
Pseudomonas sp.	8,547	0,001	3,907	0,003
Streptococcus sp.	2,687	0,001	1,012	0,060

Tabla 6

Especies bacterianas identificadas molecularmente a partir de colonias aisladas en medios de cultivo

Nº	Especie bacteriana	Muestra	Total score	Query Cove	Evalué	Per. Ident			Accesión
1	Bacillus subtilis subsp. subtilis	larva	1338	100%	0.0		100,00%	CP051466,1
2	Paenibacillus xylanilyticus	Pupa	2304	100%	0.0		99,62%	CP044310,1
3	Humibacter sp.	Adulto	2469	99%	0.0		98,99%	CP031192,1
4	Acinetobacter nectaris	Adulto	422	97%	5e-114		98,33%	MG645311,1
5	Acinetobacter sp.	Adulto	1269	100%	0.0		99,29%	HQ284953,1
6	Fructobacillus sp.	Adulto	409	100%	4e-110		96,39%	JN167936,1

b. Microbiota intestinal pendiente de medio de   cultivo

Mediante técnicas de medio de cultivo (Tabla 6), fueron identificadas seis cepas bacterianas provenientes de los estados de desarrollo de M. mimetica con su respectiva homología para huevo, Bacillus subtilis subsp. Subtilis con 100%, pupa Paenibacillus xylanilyticus con 99,62% y adulto cuatro especies con su respectiva homología, Humibacter sp. 98,99%, Acinetobacter nectaris con 98,33%, Acinetobacter sp., y Fructobacillus sp. con 100%.

Los resultados obtenidos muestran una variada microbiota en los estados de vida de M. mimetica, donde se aprecia seis géneros muy relacionados a estos, de los cuales Acetinobacter sp., es reportado que habita en el agua y suelo, siendo un importante patógeno de infecciones hospitalarias; Clostridium sp., habitante de la flora intestinal de animales y humanos reportados por degradar azúcares, alcoholes, aminoácidos, purinas, pirimidinas y polímeros como el almidón y la celulosa, (Dürre et al., 2014); Pseudomonas presente en el suelo, agua dulce, filosfera y rizosfera de plantas e insectos, así mismo; Lactobacillus sp., Pediococcus sp. y Streptococcus sp., que pertenecen al grupo de bacterias del ácido láctico (BAL) de gran importancia en la salud de las abejas, (Díaz et al., 2017; Kwong et al., 2016 y Ribière et al., 2019), y la mayor presencia de Lactobacillus sp., como indicador de la buena salud de las abejas, (Ribbera et al., 2013).

Los microrganismos que forman parte de la microbiota de las abejas sin aguijón, provienen en gran parte de las fuentes de alimento como el polen y néctar colectados para la alimentación de los miembros de la colonia, así como también de agua y materiales que usan y manejan para la construcción de sus nidos, envases para almacenar la miel y el polen. Resultados que concuerdan con los reportados por; (Bárbara et al., 2015; Zheng et al., 2019., Vit et al., 2018; Voulgari-Kokota et al., 2019).

La presencia de estos géneros de bacterias en la microbiota de M. mimetica al igual que en otros animales es de importancia de la salud de los miembros de la colonia cumpliendo funciones metabólicas en la digestión, transformación de los alimentos y el mejoramiento del sistema inmune, estos resultados concuerdan con los reportados por (Hansen et al., 2014; Leonhardt et al., 2014; Shanks et al., 2017., Alberoni et al., 2018; Endo et al., 2018; Menegatti et al., 2018; Zheng et al., 2019).

Los resultados de esta investigación nos permitirán realizar otros trabajos como la biología, comportamiento y formas de conservación de M. mimética y su relación con su microbiota.

CONCLUSIONES

A nivel molecular, se identificaron los géneros de “abejas nativas sin aguijón”: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp. Mediante el uso de tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA y del análisis bioinformático.

En la microbiota interna de M. mimetica de los géneros de bacterias identificados, los de mayor porcentaje en los estados de desarrollo fueron: en huevo 85 géneros, donde Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11,039% y Pseudomonas sp. 8,547%; en larva: 4 géneros, siendo Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%; en pupa 79 géneros: Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,421% y Brevundimonas sp. 5,402%; y en adulto (obrera) se identificaron 53 géneros bacterianos; Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%, los de mayor porcentaje respectivamente.

Estos resultados conducen a realizar un programa de conservación y valorización mediante la crianza masal de “abejas nativas sin aguijón”, generando así una fuente de ingreso para agricultores y ganaderos.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Tumbes por el financiamiento del Proyecto a través de Recursos Canon.

A Incabiotec y su equipo de investigadores por la identificación molecular de las especies.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Álvarez, L., & L. Mariano. (2020). Una especie nueva de Trigonisca y nuevos registros de abejas sin aguijón para la Argentina (Hymenóptera: Apidae). Caldasia, 40(2), 232-245.

Alberoni, D., Baffoni, L., Gaggìa, F., Ryan, P. M., Murphy, K., Ross, P. R., Stanton, C., & Di. Gioia. (2018). Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes, 9(2), 269–278.

Arnold, N., Zepeda, R., Vásquez, D., & M. Aldasoro. (2018). Las abejas sin aguijón y su cultivo en Oaxaca, México con catálogo de especies. El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR). 1ra. (Ed). Chiapas, México. 147 p.

Bárbara, M. S., Machado, C. S., Sodré, Gda. S., Dias, L. G., Estevinho, L. M., & de Carvalho, C. A. (2015). Microbiological Assessment, Nutritional Characterization and Phenolic Compounds of Bee Pollen from Mellipona mandacaia Smith. Molecules, 20(7), 12525-44.

Belkaid, Y., & O. Harrison. 2017. Homeostatic immunity and the microbiota. Immunity, 46(4), 562-576.

Chanbusarakum, L., & Ullman, D. (2008). Characterization of bacterial symbionts in Frankliniella occidentalis (Pergande), Western flower thrips. J Invertebr Pathol, 99(3), 318-25.

Delgado, C., & C. Rasmussen. (2019). Abejas sin aguijón (Apidae: Meliponini) en Loreto, Perú.

Díaz, S., Blochtein B., Sattler A., Zuge, V., & L. Haag. (2017). Report on the microbiota of Melipona quadrifasciata affected by a recurrent disease. Journal of Invertebrate Pathology, 143, 35-39.

Díaz-Castillo, N., Sánchez, D., Oyola, M., Masías, P., García-Seminario, R., Cedeño, V., & E. Mialhe. (2018). Implementación de una estrategia de espectrometría de doble masa MALDI TOT/TOF para la identificación molecular de bacterias del intestino de trips del banano. Manglar, 15(1), 57-65.

Dürre, P. 2014. Physiology and Sporulation in Clostridium. Microbiology spectrum, 2(4), TBS-0010-2012.

Elizalde, R., Castillo, P., & C. Rasmussen. (2016). Manual de abejas nativas sin aguijón de la reserva de biosfera del noroeste del Perú. Tercera edición.

Endo, A., Maeno, S., Tanizawa, Y., Kneifel, W., Arita, M., Dicks, L., & ES. Salminen. (2018). Fructophilic lactic acid bacteria, a unique group of fructose-fermenting microbes. Applied and environmental microbiology, 84(19), e01290-18.

Engel, M., & Rasmussen, C. (2017). Un nuevo subgénero de Heterotrigona de Nueva Guinea (Hymenóptera: Apidae), Journal of Melittology: No. 73: Un nuevo subgénero de Heterotrigona de Nueva Guinea (Hymenóptera: Apidae).

Engel, M., González, V., & Rasmussen, C. (2020). An overlooked family-group name among bees: Availability of Coelioxoidini (Hymenoptera: Apidae). Journal of Melittology, 94, 1-3.

Forsgren, E., Olofsson, T., Vasquez, A., & I. Fries. (2010). Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey bee larvae. Apidologie (Celle), 41, 99–108.

González, V., Alvarado, M., & C. Rasmussen. (2019). A new species of Andinopanurgus (Hymenoptera: Andrenidae) from high elevations in southern Peru. Revista Peruana de Biología, 26(2), 211-216. 

Hansen, A. K., & Moran, N. A. (2014). The impact of microbial symbionts on host plant utilization by herbivorous insects. Mol Ecol. Mar, 23(6), 1473-96.

Hebert, P., Ratnasingham, S., Dewaard, J. R., a& Landry, J.F. (2010). Evolutionary biology DNA Barcodes for 1/1000 of the animal kingdom. Biol Lett, 6, 359-362.

Josefsen, H., Andersen, C., Christensen, J., & Hoorfar, J. (2015). Microbial food safety: Potential of DNA extraction methods for use in diagnostic metagenomics. Journal of microbiological methods, 114, 30-34.

Janio, F., & Freitas, B. (2021). Richness and distribution of the Meliponine fauna (Hymenoptera: Apidae: Meliponini) in the State of Ceará, Brazil. Annals of Braziliam Academy of Sciences, 93(3), e20190767.

Kwong, W. K., & Moran, N. A. (2016). Gut microbial communities of social bees. Nature Reviews Microbiology, 14(6), 374-384.

Leonhardt, S. D., & M. Kaltenpoth. (2014). Microbial communities of three sympatric Australian stingless bee species. PloS one, 9(8), e105718.

Menegatti, C., Da Paixão Melo, W. G., Carrão, D. B., De Oliveira, A. R. M., Do Nascimento, F. S., Lopes, N. P., Pupo, M. T. (2018) Paenibacillus polymyxa associated with the stingless bee Melipona scutellaris produces antimicrobial compounds against Entomopathogens. J Chem Ecol., 44(12), 1158-1169.

Nates-Parra, G., & M. Rosso. (2013). Diversity of Stingless Bees (Hymenoptera: Meliponini) Used in Meliponiculture in Colombia. Acta Biológica Colombiana, 18(3), 415-426.  

Ngalimat, M. S., Rahman, R. N. Z. R. A., Yusof, M. T., Syahir, A., & Sabri, S. (2019). Characterisation of bacteria isolated from the stingless bee, Heterotrigona itama, honey, bee bread and propolis. PeerJ, 7, e7478. 

Pazmiño-Palomino, A., & de Oliveira, M. L. (2021). Primer caso de ginandromorfismo en la abeja orquídea Eulaema meriana (Olivier) (Hymenóptera: Apidae). Sociobiología, 68(3), ee5778. 

Paludo, R, Pishchany, G., Andrade-Domínguez, A., Silva-Junior. A., Menezes., Nascimento, C., Currie, S., Kolter, R., Clardy, J., & T. Pupo. (2019). Microbial community modulates growth of symbiotic fungus required for stingless bee metamor-phosis. PloSone, 14(7), e0219696. 

PM 7/129 (1) DNA. 2016. barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. EPPO Bull, 46, 501-537.

Rasmussen, C., & Bradley’s, J. (2016).  Narrative of the cornell entomological expeditionto South America (1919–1920): Collecting localities and entomological travel details. Journal of the History of Collections, 28, 137–147.

Rasmussen, C., & Gonzalez, V. (2017). The neotropical stingless bee genus Nannotrigona Cockerell (Hymenoptera: Apidae: Meliponini): An illustrated key, notes on the types, and designation of lectotypes. Zootaxa, 4299, 191–220.

Ribbera, A., Jï, H. M., Kant, R., Pietilï, T. E., Randazzo, C., Paulin, L., & Satokari, R. (2013). Comparative genomic and functional analysis of Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus strains marketed as probiotics. Applied and environmental microbiology, 79(6), 1923-1933.

Ribière, C., Hegarty, C., Stephenson, H., Whelan, P., O'Toole, P. W., & Whole-Body, W. (2019). Microbiota of the honey bee separate thriving and non-thriving hives. Microb Ecol., 78(1),195-205.

Romero, S., Nastasa, A., Chapman, A., Kwong, W. K., & Foster, L. J. (2019). The honey bee gut microbiota: strategies for study and characterization. Insect Mol Biol., 28(4), 455-472.

Rouzé, R., Moné, A., Delbac, F., Belzunces, L., & Blot, N. (2019). The honeybee gut microbiota is altered after chronic exposure to different families of insecticides and infection by Nosema ceranae. Microbes and environments, 34(3), 226–233.

Shanks, L., Haigh, M., Riegler, M., & N. Spooner-Hart. (2017). First confirmed report of a bacterial brood disease in stingless bees. Journal of invertebrate pathology, 144, 7–10.

Vásquez-García, A., Sangerman-Jarquín, D., & Rindermann, R. (2021). Caracterización de especies de abejas nativas y su relación biocultural en la ixteca Oaxaqueña. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 12(1), 101-113.

Vit, P., Vargas, O., López, T., & F. Valle. (2015). Meliponini biodiversity and medicinal uses of pot-honey from el Oro province in Ecuador. Emirates Journal of Food and Agriculture, 27(6), 502.

Vit, P., Maza, F., Ramirez, R., & V. Frisone. (2018). Diversity of Stingless Bees in Ecuador, Pot-Pollen Standards, and Meliponiculture Fostering a Living Museum Meliponini of the World. In Pot- Pollen in Stingless Bee Melittology (pp. 207–227). Cham: Springer International Publishing.

Voulgari-Kokota, A., Ankenbrand, M. J., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I., & A. Keller. (2019). Linking reserpollen foraging of megachilid bees to their nest bacterial microbiota. Ecology and evolution, 9(18), 10788–10800.

Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V., & Moran, N. A. (2018). Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal, 47(11), 317-325.

Zheng, H., Perreau, J., Powell, J. E., Han, B., Zhang, Z., Kwong, W. K., Tringe, S. G., & Moran, N. A. (2019). Division of labor in honey bee gut microbiota for plant polysaccharide digestion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(51), 25909–25916.