Abejas nativas sin aguijón en Tumbes, Perú:  Caracterización genómica y comunidad bacteriana

 

Native stingless bees in Tumbes, Peru: Genomic characterization and bacterial community

 

Milton Valladolid R.1, *; Henry W. Chapoñan D.1, *; Ramón García-Seminario1; Pedro G. Labán L.1; Néstor

Díaz C.1; Carlos A. Deza N.1; Miguel A. Garrido R.1; Dicson Sánchez A. 2; Jorge Zapata O. 2; Eric Louis Mialhe2

 

1 Universidad Nacional de Tumbes. Perú.

2 INCA BIOTEC S.A.C, Tumbes, Perú.

 

*Autor corresponsal: mvalla01@gmail.com  (M. Valladolid R.); echai5001@gmail.com (H. Chapoñan D.)

 

ID ORCID de los autores

M. Valladolid R.:  http://orcid.org/0000-0002-0526-0544                     H. W. Chapoñan D.:  http://orcid.org/0000-0002-4049-3466

R. García-Seminario:  http://orcid.org/0000-0003-0756-0935             Pedro G. Labán L.:  http://orcid.org/0000-0002-8107-1534

N. Díaz C.:  http://orcid.org/0000-0003-3808-5954                                  C. A. Deza N.:  http://orcid.org/0000-0002-3324-3741

M. A. Garrido R.:  http://orcid.org/0000-0002-8542-9353                     D. Sánchez A.:  http://orcid.org/0000-0001-9397-9024  

J. Zapata O.:  http://orcid.org/0000-0002-4560-8234                              E. Louis Mialhe:  http://orcid.org/0000-0002-7952-6907

 

 

RESUMEN

 

“Abejas nativas sin aguijón” se encuentran en bosques secos de la Reserva de Biosfera del Noroeste Amotapes Manglares, Tumbes, Perú, y poblaciones rurales cercanas. Estas abejas cumplen un rol importante como polinizadoras de cultivos agrícolas, forestales y como proveedoras de miel y polen", siendo Melipona mimética la especie más importante. Los objetivos del estudio fueron: la identificación molecular usando tres locis genéticos distintos (Citocromo c oxidasa, 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA), la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y análisis bioinformático, identificándose a los géneros: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp. Y haciendo uso de Metagenómica y secuencias cortas del gen 16s DNAr, comprobado en NCBI, se encontró a especies bacterianas en: huevos 139, larvas 31, pupas 154 y adultos 39, siendo las más importantes Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici, y a través de técnicas dependiente e independiente de medios de cultivo a: Bacillus subtilis subsp subtilis en larva, Paenibacillus xylanilyticus en pupa y adulto: Humibacter sp., Acinetobacter sp., Acinetobacter nectaris y Fructobacillus sp. La identificación genómica y comunidad bacteriana es relevante, por tratarse del primer estudio de estas especies en Perú.

 

Palabras clave: ADNr; PCR; microbiota; Melipona mimética; polinizadores

 

ABSTRACT

 

"Native stingless bees" are found in dry forests of the Northwest Amotapes Biosphere Reserve Mangroves, Tumbes, Peru, and nearby rural populations. These bees play an important role as pollinators of agricultural and forest crops and as suppliers of honey and pollen", Melipona mimética being the most important species. The objectives of the study were: molecular identification using three different genetic loci (Cytochrome c oxidase, 28S ribosomal RNA and 16S rRNA gene), Polymerase Chain Reaction (PCR) and bioinformatic analysis, identifying with the genres: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp.  And making use of Metagenomics and Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici,short sequences of the 16s DNAr gene, verified in NCBI, bacterial species were found: in eggs 139, larvae 31, pupae 154 and adults 39, being the most important Clostridium spp., Lactobacillus camelliae, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Pediococcus acidilactici and through media-dependent and media-independent techniques to: Bacillus subtilis subsp subtilis in larva, Paenibacillus xylanilyticus in pupa and adult: Humibacter sp., Acinetobacter sp., Acinetobacter nectaris and Fructobacillus sp. The genomic identification and bacterial community are relevant, as it is the first study of these species in Peru.

 

Keywords: rDNA; PCR; microbiota; Melipona mimética; pollinators.

 

 

 

Recibido: 11-02-2022.

Aceptado: 03-06-2022.

 

  
Esta obra está publicada bajo la licencia CC BY 4.0
 

 

 


INTRODUCCIÓN

 


Las “abejas sin aguijón” constituyen un grupo de abejas melíferas que se encuentran localizadas en los diversos ecosistemas del mundo. La mayor diversidad de especies estimadas se distribuye en el Neotrópico con 400 especies y 33 géneros aproximadamente desde México hasta Argentina (Nates-Parra et al., 2013; Vit et al., 2015; Arnold, et al., 2018), En Ecuador se han identificado las especies; Scaptotrigona ederi, Melipona mimética, M. indecisa, Paratrigona aff. y Nannotrigona cf., basándose en análisis taxonómicos y morfométricos (Vit et al., 2018).

Las Meliponas en la región de Tumbes, se encuentran dispersas en el bosque seco de la zona Reserva de Biosfera del Noroeste Amotapes-Manglares (RBNAM), así como en las poblaciones rurales cercanas a la reserva. Siendo muy apreciadas por las propiedades terapéuticas de su miel, sin embargo, su situación es muy delicada, debido a la sobreexplotación por parte de la población rural, por lo que debería catalogarse en la lista de especies en estado crítico o vulnerable. En ese contexto, surge la necesidad de realizar estudios concernientes a su identificación, biología y conservación.

Los pocos estudios de identificación que se han realizado en el Perú a nivel taxonómico de distintas especies de abejas sin aguijón, fueron realizados de características morfológicas por; (Elizalde et al., 2016; Rasmussen et al., 2016; Vásquez-García, et al., 2021), El uso de herramientas moleculares permite caracterizar especies de distintos organismos y sustancias activas de una manera rápida y eficaz (Hebert et al., 2010)

Estudios recientes de diversidad de microbiota intestinal para ser utilizados como estrategias de control, pese a que es un sistema complejo por la relación entre hongos, bacterias y el huésped (en los intestinos de las abejas), (Chanbusarakum et al., 2008). Se comprobó un crecimiento ilimitado de baterías intestinales en la alimentación de larvas, llegando al 100 % de infección de bacterias, disminuyendo en prepupa, pupa y, aumentando en adulto (Paludo et al., 2019)

La literatura no reporta estudios de identificación de abejas y su microbiota a nivel molecular en el Perú, por lo que esta investigación muestra los primeros antecedentes de una secuencia genómica y los microorganismos bacterianos encontrados a nivel de intestino de estos insectos para programas de desarrollo de una meliponicultura y apicultura sostenible.


 

 

MATERIAL Y MÉTODOS

 


Zonas de ejecución y colección de material biológico 

Las evaluaciones se realizaron en las poblaciones rurales cercanas a Reserva de Biosfera del Noroeste de Amotapes-Manglares (RBNAM), las muestras fueron obtenidas de las localidades de Rica playa, Pampas de Hospital, Cabuyal, La Angostura, Papayal, Isla Noblecilla y La Totora, la colecta de abejas se realizó haciendo uso de una red entomológica donde estas realizaban el pecoreo sobre flores y cercanas a la entrada de la colonia (piquera), así como directamente de las cajas racionales de pequeños meliponarios, siendo depositadas en tubos falcón de 50 ml conteniendo buffer twin al 2%, siguiendo protocolos establecidos y luego llevadas, en Criobox con GelPack al Laboratorio de Biología Molecular de la empresa INCA’BIOTEC S.A.C.

 

Identificación de Melipona mimética

Las muestras se desinfectaron siguiendo el protocolo, el proceso se inició seccionándole la pata trasera para abejas grande, patas y tórax para medianas y cuerpo entero para especímenes pequeños, el procedimiento utilizado fue una modificación al método del acetato de potasio, para las reacciones de PCR se utilizaron primers del gen COI, LCO1490 y HCO2198, del (PM 7/129 (1) DNA., 2016), del gen 28S los primers 28s D2F y 28s D3R, así mismo del gen 16S con los primers 16SWb y 16SWa para preparar el mix usado en PCR con un volumen final de 24 μL, que contenían 19,7 μL de agua libre de nucleasas, 2,5 μL de buffer 10X, 0.5 μL de dNTP’s 10mM, 0,6 μL de cada primers: Forward 15μM, Reverse15μM y 0,1 μL de Taq DNA polymerase 5U/μL; agregándoseles a cada una 1 μL de ADN genómico (Josefsen et al., 2015).

Se utilizó un termociclador TurboCycler 2 de Blue-Ray Biotech para la amplificación, realizándose un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg, con un alineamiento a 50 °C por 45 seg, y dos extensiones a 72 °C, una por 1 min y la final por 7 min.

Los productos de PCR se tiñeron con 2 µl de azul de bromofenol + 8 µl del amplicón, estos fueron migrados en gel de agarosa al 1% a 90 Voltios por 25 min y posteriormente se visualizaron bajo luz UV. Posteriormente, se visualizaron en un transluminador. UV TMW-20

Los amplicones obtenidos en la PCR, fueron secuenciados en la empresa Magrogen-EE.UU. Las secuencias obtenidas, fueron comparadas con la base de datos de GenBank del NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) para determinar mayor porcentaje de homología.

 

Identificación de comunidad bacteriana

Se colectaron muestras de los estados de desarrollo: huevo, larva pupa y adulto, de M. mimética de un meliponario ubicado en el distrito de Pampas de Hospital, región Tumbes, se utilizaron bolsas ziploc para llevarlas al laboratorio, en discos de cría conteniendo tubos eppendorf.

 

Microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo.

Las muestras biológicas fueron congeladas y depositadas por separado en tubos eppendorf de 2 ml, posteriormente fueron llevadas a cámara con UV donde se desinfectaron superficialmente adicio-nando etanol al 70 % por 3 min, luego se eliminó y se adicionó NaClO al 1% por 30 seg, se les enjuago 3 veces con agua destilada y esterilizada, posterior-mente las muestras fueron maceradas, utilizándose una parte para la extracción de ADN (meta-genómica) (Díaz et al., 2018).

 

Microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo

Parte de las muestras maceradas, fueron agregadas por separado a 1 ml de agua destilada, se homogenizo y se tomaron 20 µl de las muestras para ser esparcidas en cajas petri conteniendo el medio de cultivo TSA, las cuales fueron incubadas por 24 horas, posteriormente purificadas y cultivadas en caldo LB por 24 horas (Díaz et al., 2018). 

 

Extracción de ADN de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes y dependientes del medio de cultivo

Para extraer el ADN metagenómico de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo, se tomó una parte de cada muestra macerada y se procedió con la aplicación del protocolo recomendado por el kit comercial PowerSoil® DNA Isolation Kit, (Josefsen et al. 2015). Así mismo para la microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo, se usaron cepas bacterianas purificadas las cuales fueron centrifugadas a 13,000 rpm, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento fue resuspendido en 1 ml de solución tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA). Las bacterias fueron sometidas a una locis celular por adición de 30 µl de SDS (10%) y 3 µl de proteinasa K (37 °C, 1 hora), se añadió 100 µl de NaCl (5M) y 80 µl de CTAB/NaCl (previamente calentado a 65 °C) y se incubaron a 65 °C por 10 min. Posteriormente, se adicionó cloroformo/alcohol isoamil (24:1) y tras centrifugarse a 13,000 rpm por 5 min, se añadió 0,6 ml de isopropanol, volviéndose a centrifugar a 1,200 rpm por 5 min, se descartó al sobrenadante y al precipitado se le adicionó 1ml de etanol frío, y nuevamente se centrifugó a 12,000 rpm 5 min, se eliminó el etanol mediante secado a temperatura ambiente por 5 min, y se obtuvo los ácidos nucleicos a los cuales se les adicionaron 30 𝑢l de tampón TE y 1 µl de solución de RNAsa a 37 °C  por 1 hora para eliminar el ARNs y obtener el ADN puro (Díaz et al., 2018 y Ribière et al., 2019).

 

Amplificación del gen del ADNr 16S

Se utilizaron los primers universales 27-f Forward 5'AGAGTTTGATCMTGGCTC- 3' y 1492-r Reverse 5' – TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3' (Belkaid et al. 2017), para lo cual se utilizó un mix de reacción para la amplificación del gen del ADNr 16S compuesto de Buffer Taq 10X 2,5µL, MgCl₂ 25mM 2,5µL, dNTP’s 10mM 0,5µL, Taq Polimerase 5U/ µL 0,1µL, 16s ARNr F 0,6, 16s ARNr R 0,6, Agua ultra pura 16,2µL, ADN 3µL, con un volumen final 25µL. La PCR con un programa de desnaturalización inicial 94 °C en 5 min 1 ciclo, y otro por 30 seg, Hibridación 49 °C en 60 seg, Elongación de 72°C por 1 min con 35 ciclos, y la final 72 °C por 4 min por 1 ciclo y a temperatura final de conservación de 4 °C (Díaz et al. 2018).

 

Obtención de la secuencia parcial del gen del ADN ribosómico 16S

La secuenciación nucleotídica se realizó empleando primers internos 16S ADNr 518F y 16S ADNr 800R, las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas con el software BLAST usando la base de datos del 16S ADNr del GEN BANK y el programa MEGA 6. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information – USA).       


 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 


La identificación molecular de las “abejas sin aguijón”, fue mediante tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA, utilizados en la identificaciones de hymenópteros (González et al., 2019; Engel, et al., 2020) y para la identificación  de los géneros: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp.,  Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp.,  Trigona sp. y Trigonisca sp., mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el uso del análisis bioinformático. Resultados concordantes con los reportados por (Engel et al., 2017; Rasmussen et al., 2017; Delgado et al., 2019; Álvarez, et al., 2020; Janio et al., 2020; Pazmiño-Palomino et al., 2021).

 

En la comunidad bacteriana

a. Microbiota intestinal independiente de medio de cultivo

Mediante metagenómica se identificó 85 géneros de bacterias que conforman la microbiota interna del estado de huevo en M. mimetica (Tabla 1), siendo Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11.039% y Pseudomonas sp., 8,547%, siendo los de mayor porcentaje los 5 primeros de la tabla; en el estado de larva fueron identificados 14 géneros (Tabla 2), de los cuales Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%, los porcentajes más representativos; en pupa 79 géneros (Tabla 3), Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,42% y Brevundimonas sp. 5,402%, siendo los 8 primeros los de mayor porcentaje; para estado adulto (obrera) (Tabla 4), se identificó 53 géneros bacterianos, siendo los 3 primeros los de mayor porcentaje Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%. Además, se identificó 6 géneros de bacterias presentes en la microbiota de los estados de desarrollo (Tabla 5), siendo Lactobacillus sp., el de mayor porcentaje, resultados que concuerdan con los reportados por (Dürre et al., 2014; Forsgren et al., 2017; Belkaid et al., 2017; Ngalimat et al., 2019; Ribière et al., 2019; Romero et al., 2019; Rouzé et al., 2019).

 


Tabla 1

Géneros de bacterias identificados en la microbiota interna del estado de huevo de M. mimetica

 

Género

Porcentaje

Género

Porcentaje

1

Acinetobacter sp.

17,663

44

Haliscomenobacter sp.

0,010

2

Lactobacillus sp.

13,411

45

Polaribacter sp.

0,010

3

Alishewanella sp.

11,350

46

Thalassomonas sp.

0,010

4

Shewanella sp.

11,039

47

Roseovarius sp.

0,010

5

Pseudomonas sp.

8,547

48

Thalassobius sp.

0,010

6

Cloacibacterium sp.

3,705

49

Bdellovibrio sp.

0,006

7

Kaistobacter sp.

3,497

50

Clostridium sp.

0,006

8

Intestinibacter sp.

3,381

51

Demequina sp.

0,006

9

Corynebacterium sp.

2,960

52

Escherichia sp.

0,006

10

Finegoldia sp.

2,707

53

Granulosicoccus sp.

0,006

11

Streptococcus sp.

2,687

54

Lewinella sp.

0,006

12

Ruminococcus sp.

2,498

55

Sagittula sp.

0,006

13

Paracoccus sp.

2,476

56

Spongiimonas sp.

0.006

14

Bacillus sp.

2,293

57

Verrucomicrobium sp.

0,006

15

Aliihoeflea sp.

2,090

58

Agarivorans sp.

0,003

16

Brevundimonas sp.

1,865

59

Alkaliphilus sp.

0,003

17

Peptoniphilus sp.

1,438

60

Bergeyella sp.

0,003

18

Lysobacter sp.

1,243

61

Chloroflexus sp.

0,003

19

Rhodobacter sp.

1,072

62

Citreicella sp.

0,003

20

Pantoea sp.

0,857

63

Coxiella sp.

0,003

21

Sphaerobacter sp.

0,822

64

Dechloromarinus sp.

0,003

22

Rhodovulum sp.

0,482

65

Desulfuromusa sp.

0.003

23

Actinotalea sp.

0,462

66

Donghicola sp.

0,003

24

Thiovirga sp.

0,231

67

Dyella sp.

0,003

25

Empedobacter sp.

0,228

68

Enterococcus sp.

0,003

26

Pediococcus sp.

0,128

69

Flexibacter sp.

0,003

27

Roseobacter sp.

0,125

70

Haliea sp.

0,003

28

Candidatus sp.

0,096

71

Haloferula sp.

0,003

29

Helicobacter sp.

0,058

72

Holospora sp.

0,003

30

Spongiibacter sp.

0,058

73

Imtechella sp.

0,003

31

Vibrio sp.

0,045

74

Jannaschia sp.

0.003

32

Cronobacter sp.

0,042

75

Marivita sp.

0,003

33

Kwoniella sp.

0,039

76

Mycoplasma sp.

0,003

34

Pedobacter sp.

0,032

77

Oleispira sp.

0,003

35

Raoultella sp.

0,029

78

Oligoflexus sp.

0,003

36

Flavobacterium sp.

0,029

79

Owenweeksia sp.

0,003

37

Olleya sp.

0,026

80

Pinguiococcus sp.

0,003

38

Tenacibaculum sp.

0,026

81

Pirellula sp.

0,003

39

Phaeobacter sp.

0,016

82

Synechococcus sp.

0,003

40

Rubritalea sp.

0,016

83

Terasakiella sp.

0,003

41

Ruegeria sp.

0,013

84

Tropicibacter sp.

0,003

42

Tabrizicola sp.

0,013

85

Ulvibacter sp.

0,003

43

Chlorella sp.

0,010

 

 

 

 

 

 

Tabla 2

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de larva de M. mimetica

 

Genero

Porcentaje

1

Lactobacillus sp.

55,213

2

Coprobacillus sp.

25,489

3

Clostridium sp.

12,754

4

Pediococcus sp.

6,536

5

Stenotrophomonas sp.

0,003

6

Streptococcus sp.

0,001

7

Algoriphagus sp.

0,001

8

Barnesiella sp.

0,001

9

Candidatus stoquefichus sp.

0,001

10

Halospirulina sp.

0,001

11

Pseudomonas sp.

0,001

12

Stakelama sp.

0,001

13

Staphylococcus sp.

0,001

14

Acinetobacter sp.

0,001

 

 

 

 

Tabla 3

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de pupa de M. mimetica

 

Genero

Porcentaje

Genero 

Porcentaje

1

Acinetobacter sp.

21,188

41

Pediococcus sp.

0,238

2

Staphylococcus sp.

8,118

42

Peptoniphilus sp.

0,226

3

Lactobacillus sp.

7,909

43

Oceanicola sp.

0,221

4

Planomicrobium sp.

6,531

44

Marmoricola sp.

0,198

5

Corynebacterium sp.

5,785

45

Jannaschia sp.

0,182

6

Micrococcus sp.

5,670

46

Pantoea sp.

0,165

7

Kocuria sp.

5,421

47

Shigella sp.

0,156

8

Brevundimonas sp.

5,402

48

Thermincola sp.

0,120

9

Pseudomonas sp.

3,907

49

Cronobacter sp.

0,084

10

Massilia sp.

2,375

50

Sulfurimonas sp.

0,081

11

Vibrio sp.

1,979

51

Raoultella sp.

0,073

12

Lentibacillus

1,836

52

Tropicibacter sp.

0,070

13

Streptomyces sp.

1,624

53

Ruegeria sp.

0,070

14

Loktanella sp.

1,557

54

Anoxybacillus sp.

0,067

15

Turicella sp.

1,478

55

Rothia sp.

0,061

16

Blastococcus sp.

1,428

56

Pectobacterium sp.

0.059

17

Tabrizicola sp.

1,425

57

Poseidonocella sp,

0,059

18

Comamonas sp.

1,333

58

Roseivivax sp.

0,048

19

Rhodovulum sp.

1,216

59

Serratia sp.

0,048

20

Streptococcus sp.

1,012

60

Roseobacter sp.

0,042

21

Cellulomonas sp.

0,794

61

Legionella sp.

0,031

22

Tropicimonas sp.

0,794

62

Enhydrobacter

0,022

23

Escherichia sp.

0,782

63

Candidatus saccharimonas

0,020

24

Eubacterium sp.

0,771

64

Planococcus sp.

0,020

25

Halospirulina sp.

0,721

65

Roseburia sp.

0,020

26

Paracoccus sp.

0,679

66

Lysinibacillus sp.

0,011

27

Anaerococcus sp.

0,668

67

Pseudoruegeria sp.

0,011

28

Enterobacter sp.

0,592

68

Aquabacterium sp.

0,008

29

Rhodobacter sp.

0,590

69

Hydrogenophaga sp.

0,008

30

Chryseobacterium sp.

0,539

70

Pelomonas sp.

0,006

31

Collinsella sp.

0,456

71

Phaeobacter sp.

0,006

32

Sphingobium sp.

0,422

72

Roseinatronobacter sp.

0,006

33

Prevotella sp.

0,411

73

Sagittula sp.

0,006

34

Flavobacterium sp.

0,377

74

Barnesiella sp.

0,003

35

Clostridium sp.

0,360

75

Bordetella sp.

0,003

36

Citrobacter sp.

0,313

76

Maritimibacter sp.

0,003

37

Bacillus sp.

0,296

77

Marivita sp.

0,003

38

Wohlfahrtiimonas sp.

0,277

78

Phyllobacterium sp.

0,003

39

Ornithinimicrobium sp.

0,260

79

Synechococcus sp.

0,003

40

Achromobacter sp.

0,249

 

 

 

 

Tabla 4

Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de adulto (obrera) de M. mimetica

 

Género

Porcentaje

Género

Porcentaje

1

Lactobacillus sp.

91,809

28

Weissella sp.

0,001

2

Pediococcus sp.

5,101

29

Achromatium sp.

0,001

3

Halospirulina sp.

2,399

30

Algoriphagus sp.

0,001

4

Acetobacter sp.

0,422

31

Anoxybacillus sp.

0,001

5

Herbiconiux sp.

0,094

32

Arthrobacter sp.

0,001

6

Streptococcus sp.

0,060

33

Bradyrhizobium sp.

0,001

7

Bacillus sp.

0,024

34

Candidatus bacilloplasma

0,001

8

Staphylococcus sp.

0,011

35

Comamonas sp.

0,001

9

Acinetobacter sp.

0,009

36

Donghicola sp.

0,001

10

Azospirillum sp.

0,007

37

Enterobacter sp.

0,001

11

Clostridium sp.

0,006

38

Escherichia sp.

0,001

12

Barnesiella sp.

0,006

39

Eubacterium sp.

0,001

13

Enterococcus sp.

0,005

40

Granulosicoccus sp.

0,001

14

Asaia sp.

0,003

41

Helicobacter sp.

0,001

15

Candidatus odyssella

0,003

42

Hyphomicrobium sp.

0,001

16

Kocuria sp.

0,003

43

Lentibacillus sp.

0.001

17

Pseudomonas sp.

0,003

44

Lyticum sp.

0,001

18

Lachnoclostridium sp.

0,003

45

Massilia sp.

0,001

19

Brevundimonas sp.

0,002

46

Micrococcus sp.  

0,001

20

Loktanella sp.

0,002

47

Paracoccus sp.

0,001

21

Pseudoalteromonas sp.

0,002

48

Photobacterium sp.

0,001

22

Turicella sp.

0,002

49

Planomicrobium sp.

0,001

23

Candidatus Stoquefichus

0,001

50

Shewanella sp.

0,001

24

Chryseobacterium sp.

0,001

51

Spongiibacter sp.

0,001

25

Conexibacter sp.

0,001

52

Tabrizicola sp.

0,001

26

Corynebacterium sp.

0,001

53

Vibrio sp.

0,001

27

Rubellimicrobium sp.

0,001

 

 

 

Tabla 5

Géneros de bacterias identificados en la microbiota de los estados de desarrollo de M. mimetica

 

Género

Huevo

Larva

Pupa

Adulto

Acinetobacter sp.

17,663

0,001

21,188

0,009

Clostridium sp.

0,006

12,754

0,360

0,006

Lactobacillus sp.

13,411

55,213

7,909

91,809

Pediococcus sp.

0,128

6,536

0,238

5,101

Pseudomonas sp.

8,547

0,001

3,907

0,003

Streptococcus sp.

2,687

0,001

1,012

0,060

 

Tabla 6

Especies bacterianas identificadas molecularmente a partir de colonias aisladas en medios de cultivo

 

Especie bacteriana

Muestra

Total score

Query Cove

Evalué

Per. Ident

Accesión

1

Bacillus subtilis

subsp. subtilis

larva

1338

100%

0.0

100,00%

CP051466,1

2

Paenibacillus xylanilyticus

Pupa

2304

100%

0.0

99,62%

CP044310,1

3

Humibacter sp.

Adulto

2469

99%

0.0

98,99%

CP031192,1

4

Acinetobacter nectaris

Adulto

422

97%

5e-114

98,33%

MG645311,1

5

Acinetobacter sp.

Adulto

1269

100%

0.0

99,29%

HQ284953,1

6

Fructobacillus sp.

Adulto

409

100%

4e-110

96,39%

JN167936,1

 

 


b. Microbiota intestinal pendiente de medio de   cultivo

Mediante técnicas de medio de cultivo (Tabla 6), fueron identificadas seis cepas bacterianas provenientes de los estados de desarrollo de M. mimetica con su respectiva homología para huevo, Bacillus subtilis subsp. Subtilis con 100%, pupa Paenibacillus xylanilyticus con 99,62% y adulto cuatro especies con su respectiva homología, Humibacter sp. 98,99%, Acinetobacter nectaris con 98,33%, Acinetobacter sp., y Fructobacillus sp. con 100%.

Los resultados obtenidos muestran una variada microbiota en los estados de vida de M. mimetica, donde se aprecia seis géneros muy relacionados a estos, de los cuales Acetinobacter sp., es reportado que habita en el agua y suelo, siendo un importante patógeno de infecciones hospitalarias; Clostridium sp., habitante de la flora intestinal de animales y humanos reportados por degradar azúcares, alcoholes, aminoácidos, purinas, pirimidinas y polímeros como el almidón y la celulosa, (Dürre et al., 2014); Pseudomonas presente en el suelo, agua dulce, filosfera y rizosfera de plantas e insectos, así mismo; Lactobacillus sp., Pediococcus sp. y Streptococcus sp., que pertenecen al grupo de bacterias del ácido láctico (BAL) de gran importancia en la salud de las abejas, (Díaz et al., 2017; Kwong et al., 2016 y Ribière et al., 2019), y la mayor presencia de Lactobacillus sp., como indicador de la buena salud de las abejas, (Ribbera et al., 2013).

Los microrganismos que forman parte de la microbiota de las abejas sin aguijón, provienen en gran parte de las fuentes de alimento como el polen y néctar colectados para la alimentación de los miembros de la colonia, así como también de agua y materiales que usan y manejan para la construcción de sus nidos, envases para almacenar la miel y el polen. Resultados que concuerdan con los reportados por; (Bárbara et al., 2015; Zheng et al., 2019., Vit et al., 2018; Voulgari-Kokota et al., 2019).

La presencia de estos géneros de bacterias en la microbiota de M. mimetica al igual que en otros animales es de importancia de la salud de los miembros de la colonia cumpliendo funciones metabólicas en la digestión, transformación de los alimentos y el mejoramiento del sistema inmune, estos resultados concuerdan con los reportados por (Hansen et al., 2014; Leonhardt et al., 2014; Shanks et al., 2017., Alberoni et al., 2018; Endo et al., 2018; Menegatti et al., 2018; Zheng et al., 2019).

Los resultados de esta investigación nos permitirán realizar otros trabajos como la biología, comportamiento y formas de conservación de M. mimética y su relación con su microbiota.


 

CONCLUSIONES

 


A nivel molecular, se identificaron los géneros de “abejas nativas sin aguijón”: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp. Mediante el uso de tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA y del análisis bioinformático.

En la microbiota interna de M. mimetica de los géneros de bacterias identificados, los de mayor porcentaje en los estados de desarrollo fueron: en huevo 85 géneros, donde Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11,039% y Pseudomonas sp. 8,547%; en larva: 4 géneros, siendo Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%; en pupa 79 géneros: Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,421% y Brevundimonas sp. 5,402%; y en adulto (obrera) se identificaron 53 géneros bacterianos; Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%, los de mayor porcentaje respectivamente.

Estos resultados conducen a realizar un programa de conservación y valorización mediante la crianza masal de “abejas nativas sin aguijón”, generando así una fuente de ingreso para agricultores y ganaderos.


AGRADECIMIENTOS

 


A la Universidad Nacional de Tumbes por el financiamiento del Proyecto a través de Recursos Canon.

A Incabiotec y su equipo de investigadores por la identificación molecular de las especies.

 


 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 


Álvarez, L., & L. Mariano. (2020). Una especie nueva de Trigonisca y nuevos registros de abejas sin aguijón para la Argentina (Hymenóptera: Apidae). Caldasia, 40(2), 232-245.

Alberoni, D., Baffoni, L., Gaggìa, F., Ryan, P. M., Murphy, K., Ross, P. R., Stanton, C., & Di. Gioia. (2018). Impact of beneficial bacteria supplementation on the gut microbiota, colony development and productivity of Apis mellifera L. Beneficial microbes9(2), 269–278.

Arnold, N., Zepeda, R., Vásquez, D., & M. Aldasoro. (2018). Las abejas sin aguijón y su cultivo en Oaxaca, México con catálogo de especies. El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR). 1ra. (Ed). Chiapas, México. 147 p.

Bárbara, M. S., Machado, C. S., Sodré, Gda. S., Dias, L. G., Estevinho, L. M., & de Carvalho, C. A. (2015). Microbiological Assessment, Nutritional Characterization and Phenolic Compounds of Bee Pollen from Mellipona mandacaia Smith. Molecules, 20(7), 12525-44.

Belkaid, Y., & O. Harrison. 2017. Homeostatic immunity and the microbiota. Immunity, 46(4), 562-576.

Chanbusarakum, L., & Ullman, D. (2008). Characterization of bacterial symbionts in Frankliniella occidentalis (Pergande), Western flower thrips. J Invertebr Pathol, 99(3), 318-25.

Delgado, C., & C. Rasmussen. (2019). Abejas sin aguijón (Apidae: Meliponini) en Loreto, Perú.

Díaz, S., Blochtein B., Sattler A., Zuge, V., & L. Haag. (2017). Report on the microbiota of Melipona quadrifasciata affected by a recurrent disease. Journal of Invertebrate Pathology, 143, 35-39.

Díaz-Castillo, N., Sánchez, D., Oyola, M., Masías, P., García-Seminario, R., Cedeño, V., & E. Mialhe. (2018). Implementación de una estrategia de espectrometría de doble masa MALDI TOT/TOF para la identificación molecular de bacterias del intestino de trips del banano. Manglar, 15(1), 57-65.

Dürre, P. 2014. Physiology and Sporulation in Clostridium. Microbiology spectrum, 2(4), TBS-0010-2012.

Elizalde, R., Castillo, P., & C. Rasmussen. (2016). Manual de abejas nativas sin aguijón de la reserva de biosfera del noroeste del Perú. Tercera edición.

Endo, A., Maeno, S., Tanizawa, Y., Kneifel, W., Arita, M., Dicks, L., & ES. Salminen. (2018). Fructophilic lactic acid bacteria, a unique group of fructose-fermenting microbes. Applied and environmental microbiology, 84(19), e01290-18.

Engel, M., & Rasmussen, C. (2017). Un nuevo subgénero de Heterotrigona de Nueva Guinea (Hymenóptera: Apidae), Journal of Melittology: No. 73: Un nuevo subgénero de Heterotrigona de Nueva Guinea (Hymenóptera: Apidae).

Engel, M., González, V., & Rasmussen, C. (2020). An overlooked family-group name among bees: Availability of Coelioxoidini (Hymenoptera: Apidae). Journal of Melittology, 94, 1-3.

Forsgren, E., Olofsson, T., Vasquez, A., & I. Fries. (2010). Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey bee larvae. Apidologie (Celle), 41, 99–108.

González, V., Alvarado, M., & C. Rasmussen. (2019). A new species of Andinopanurgus (Hymenoptera: Andrenidae) from high elevations in southern Peru. Revista Peruana de Biología, 26(2), 211-216. 

Hansen, A. K., & Moran, N. A. (2014). The impact of microbial symbionts on host plant utilization by herbivorous insects. Mol Ecol. Mar, 23(6), 1473-96.

Hebert, P., Ratnasingham, S., Dewaard, J. R., a& Landry, J.F. (2010). Evolutionary biology DNA Barcodes for 1/1000 of the animal kingdom. Biol Lett, 6, 359-362.

Josefsen, H., Andersen, C., Christensen, J., & Hoorfar, J. (2015). Microbial food safety: Potential of DNA extraction methods for use in diagnostic metagenomics. Journal of microbiological methods, 114, 30-34.

Janio, F., & Freitas, B. (2021). Richness and distribution of the Meliponine fauna (Hymenoptera: Apidae: Meliponini) in the State of Ceará, Brazil. Annals of Braziliam Academy of Sciences, 93(3), e20190767.

Kwong, W. K., & Moran, N. A. (2016). Gut microbial communities of social bees. Nature Reviews Microbiology, 14(6), 374-384.

Leonhardt, S. D., & M. Kaltenpoth. (2014). Microbial communities of three sympatric Australian stingless bee species. PloS one, 9(8), e105718.

Menegatti, C., Da Paixão Melo, W. G., Carrão, D. B., De Oliveira, A. R. M., Do Nascimento, F. S., Lopes, N. P., Pupo, M. T. (2018) Paenibacillus polymyxa associated with the stingless bee Melipona scutellaris produces antimicrobial compounds against Entomopathogens. J Chem Ecol., 44(12), 1158-1169.

Nates-Parra, G., & M. Rosso. (2013). Diversity of Stingless Bees (Hymenoptera: Meliponini) Used in Meliponiculture in Colombia. Acta Biológica Colombiana, 18(3), 415-426.  

Ngalimat, M. S., Rahman, R. N. Z. R. A., Yusof, M. T., Syahir, A., & Sabri, S. (2019). Characterisation of bacteria isolated from the stingless bee, Heterotrigona itama, honey, bee bread and propolis. PeerJ, 7, e7478. 

Pazmiño-Palomino, A., & de Oliveira, M. L. (2021). Primer caso de ginandromorfismo en la abeja orquídea Eulaema meriana (Olivier) (Hymenóptera: Apidae). Sociobiología, 68(3), ee5778. 

Paludo, R, Pishchany, G., Andrade-Domínguez, A., Silva-Junior. A., Menezes., Nascimento, C., Currie, S., Kolter, R., Clardy, J., & T. Pupo. (2019). Microbial community modulates growth of symbiotic fungus required for stingless bee metamor-phosis. PloSone, 14(7), e0219696. 

PM 7/129 (1) DNA. 2016. barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. EPPO Bull, 46, 501-537.

Rasmussen, C., & Bradley’s, J. (2016).  Narrative of the cornell entomological expeditionto South America (1919–1920): Collecting localities and entomological travel details. Journal of the History of Collections, 28, 137–147.

Rasmussen, C., & Gonzalez, V. (2017). The neotropical stingless bee genus Nannotrigona Cockerell (Hymenoptera: Apidae: Meliponini): An illustrated key, notes on the types, and designation of lectotypes. Zootaxa, 4299, 191–220.

Ribbera, A., Jï, H. M., Kant, R., Pietilï, T. E., Randazzo, C., Paulin, L., & Satokari, R. (2013). Comparative genomic and functional analysis of Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus strains marketed as probiotics. Applied and environmental microbiology, 79(6), 1923-1933.

Ribière, C., Hegarty, C., Stephenson, H., Whelan, P., O'Toole, P. W., & Whole-Body, W. (2019). Microbiota of the honey bee separate thriving and non-thriving hives. Microb Ecol., 78(1),195-205.

Romero, S., Nastasa, A., Chapman, A., Kwong, W. K., & Foster, L. J. (2019). The honey bee gut microbiota: strategies for study and characterization. Insect Mol Biol., 28(4), 455-472.

Rouzé, R., Moné, A., Delbac, F., Belzunces, L., & Blot, N. (2019). The honeybee gut microbiota is altered after chronic exposure to different families of insecticides and infection by Nosema ceranae. Microbes and environments, 34(3), 226–233.

Shanks, L., Haigh, M., Riegler, M., & N. Spooner-Hart. (2017). First confirmed report of a bacterial brood disease in stingless bees. Journal of invertebrate pathology, 144, 7–10.

Vásquez-García, A., Sangerman-Jarquín, D., & Rindermann, R. (2021). Caracterización de especies de abejas nativas y su relación biocultural en la ixteca Oaxaqueña. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 12(1), 101-113.

Vit, P., Vargas, O., López, T., & F. Valle. (2015). Meliponini biodiversity and medicinal uses of pot-honey from el Oro province in Ecuador. Emirates Journal of Food and Agriculture, 27(6), 502.

Vit, P., Maza, F., Ramirez, R., & V. Frisone. (2018). Diversity of Stingless Bees in Ecuador, Pot-Pollen Standards, and Meliponiculture Fostering a Living Museum Meliponini of the World. In Pot- Pollen in Stingless Bee Melittology (pp. 207–227). Cham: Springer International Publishing.

Voulgari-Kokota, A., Ankenbrand, M. J., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I., & A. Keller. (2019). Linking reserpollen foraging of megachilid bees to their nest bacterial microbiota. Ecology and evolution, 9(18), 10788–10800.

Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V., & Moran, N. A. (2018). Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal, 47(11), 317-325.

Zheng, H., Perreau, J., Powell, J. E., Han, B., Zhang, Z., Kwong, W. K., Tringe, S. G., & Moran, N. A. (2019). Division of labor in honey bee gut microbiota for plant polysaccharide digestion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(51), 25909–25916.