Aislamiento e identificación de Leishmania sp de Amblyomma naponense y Amblyomma humerale colectadas de Pecari tajacu, Tayassu pecari y Chelonoide denticulata

Isolation and identification of Leishmania sp of Amblyomma naponense and Amblyomma humerale collected from Pecari tajacu, Tayassu pecari and Chelonoide denticulata

Jesús Rojas-Jaimes ^{1,
2, *}; Daniel Zarate-Rendon ³; Gino Montoya-Arauco ⁴

1 Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Privada del Norte, Lima, Perú.

2 Escuela de Medicina Humana, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú.

3 Laboratorio de Parasitología, Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú.

4 Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú.

*Autor corresponsal: jesus.rojas.jaimes@gmail.com (J. Rojas-Jaimes).

ID ORCID de los autores

J. Rojas-Jaimes: https://orcid.org/0000-0002-6910-9341 D. Zarate-Rendon: https://orcid.org/0000-0003-3532-8084

G. Montoya-Arauco: https://orcid.org/0000-0003-1986-4557

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue aislar e identificar a Leishmania de Amblyomma naponense y Amblyomma humerale colectadas de Pecari tajacu, Tayassu pecari y Chelonoide denticulata. Se colectaron garrapatas Amblyomma naponense y Amblyomma humerale de Pecari tajacu, Tayassu pecari y Chelonoide denticulata en Madre de Dios, Perú. Se extrajeron las vísceras y glándulas salivales de las garrapatas y se hicieron observaciones directas al microscopio, se realizaron cultivos en agar sangre bifásico y se inocularon en almohadillas plantares e intraperitoneal de hámsteres. En ninguna de las observaciones, cultivos y respuesta a las inoculaciones se aisló ni identificó al parásito. Estos resultados muestran una investigación básica la cual sirve para recomendar el uso de un número mayor de garrapatas colectadas de varios animales como potenciales reservorios de Leishmania y el uso de técnica de alta sensibilidad de detección del parásito como la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Palabras clave: Leishmania; garrapata; aislamiento; reservorio; vector.

ABSTRACT

The aim of this study was to isolate and identify Leishmania from Amblyomma naponense and Amblyomma humerale collected from Pecari tajacu, Tayassu pecari and Chelonoides denticulata. Amblyomma naponense and Amblyomma humerale ticks were collected from Pecari tajacu, Tayassu pecari and Chelonoides denticulata in Madre de Dios, Peru. The viscera and salivary glands of the ticks were extracted, and direct observations were made under the microscope. Samples were cultured in biphasic blood agar and inoculated into the footpads and intraperitoneal of hamsters. In none of the observations, cultures and responses to inoculations was the parasite isolated or identified. These results show basic research which serves to recommend the use of a larger number of ticks collected from various animals as potential reservoirs of Leishmania and the use of a highly sensitive parasite detection technique such as polymerase chain reaction (PCR).

Keywords: Leishmania; tick; isolation; reservoir; vector.

Recibido: 20-04-2022.

Aceptado: 24-07-2022.

La leishmaniasis es una enfermedad causada por el protozoario Leishmania sp, entre las que figuran las especies L. braziliensis, L. guyanensis y L. amazonensis entre las más prevalentes en zonas endémicas como Perú y Brasil (Veland et al., 2011; Couto et al., 2014). La enfermedad es transmitida por un díptero llamado Lutzomya sp, el cual presenta un amplio polimorfismo entre la forma cutánea, mucosa y visceral (Savoia, 2015).

En las Américas se considera a Lutzomya sp como el vector involucrado en la transmisión del parasito Leishmania sp, aunque también se ha propuesto como transmisores a garrapatas, donde se ha identificado tanto ADN como ARN del protozoo, lo que indicaría la presencia y viabilidad del parásito en estos artrópodos (Colombo et al., 2011; Solano-Gallego et al., 2012; Dantas-Torres, 2009).

En este sentido, Rojas-Jaimes et al. (2017) colectaron garrapatas de las especies Amblyoma naponense y Rhipicephalus microplus en Tapirus terrestris y Pecari tajacu, respectivamente, detectando ADN de Leishmania sp en Rhipicephalus microplus en la región de Madre de Dios. Marotta et al. (2018) reportaron en Tayassu pecari en Brasil garrapatas de la especie Amblyomma brasiliensis, pudiendo aislar un nuevo tripanosoma llamado Trypanosoma amblyommi.

Por lo tanto, el objetivo del estudio fue determinar la presencia de Leishmania en Amblyomma naponense y Amblyomma humerale colectados de Pecari tajacu, Tayassu pecari y Chelonoide denticulata en la región de Madre de Dios, Perú.

2.1 Colecta de Garrapatas

Se coordinó con los cazadores de los distritos de Planchon “Botijón”, Iberia e Iñapari (distrito de Bélgica) en Madre de Dios, Perú, para la recolección de garrapatas en los animales que hayan sido cazados. Los pobladores de las comunidades nativas realizan la cacería de estos animales para autoconsumo.

Se colectaron 29 garrapatas de Pecari tajacu en el distrito de Bélgica, 30 de Tayassu pecari y 10 de Chelonoide denticulata en el lapso de dos semanas. Las garrapatas fueron transportadas vivas al laboratorio de parasitología de la Universidad Agraria la Molina de la escuela de Zootecnia, en frascos herméticos estériles, al laboratorio para la clasificación taxonómica y la extracción de vísceras. La clasificación taxonómica se basó en las claves de Barros-Battesti et al. (2006).

Por otro lado, y en forma casual, se colectó una garrapata del brazo de uno de los cazadores del poblado de Botijón. Se retiró todo resto de suciedad de las garrapatas con papel toalla y fueron colocadas en placas Petri conteniendo 5 a 10 gotas de una solución de suero fisiológico, antibiótico y antimicótico. Trabajando en el estereoscopio, se diseccionaron las garrapatas con ayuda de microestiletes entomológicos para exponer sus órganos internos. En el caso de las teleoginas más grandes fue necesario realizar un piquete previo a la apertura le extremo posterior del parásito.

2.2 Inoculación en hámsteres

Las garrapatas se agruparon en pooles por especie y animal de colecta. Se extrajeron las glándulas salivales y segmentos intestinales usando el estereoscopio Nikon SMZ 800N, material que fue colocados en tubos Vacutainer^® conteniendo suero fisiológico más antibiótico y antimicótico. En un tubo de ensayo de 4 ml se colocaron las vísceras y glándulas salivales de las 28 garrapatas colectados de Pecari tajacu, las cuáles una vez homogenizadas se distribuyeron en tubos de 2 ml. Asimismo, se procedió en forma similar con las vísceras y glándulas salivales de las 30 garrapatas colectados de Tayassu pecari y las 10 garrapatas colectadas de Chelonoide denticulata.

Un tubo ensayo de cada par de pooles se utilizó en la inoculación a hámsteres dorados hembras Mesocricetus auratus (0,5 ml en cada pata). El contenido del segundo tubo de ensayo de cada par fue usado para la inoculación intraperitoneal (0,5 ml), cultivo en medio bifásico (1 ml) y microscopia (0,5 ml).

2.3 Observación microscópica y cultivo

Las muestras para microscopía se colocaron en laminas portaobjetos y teñidas con Giemsa para la identificación de tripanosomátidos usando un microscopio Nikon ECLIPSE Ei. Las láminas fueron observadas a 400X y 1000X. Se realizaron cultivos de agar sangre bifásico utilizando cloruro de sodio isotónico al 0,9% con penicilina 10 mil U/ estreptomicina 10 mg/ml y sangre desfibrinada de conejo. De cada muestra se hicieron tres cultivos (repeticiones). Las muestras fueron incubadas a 25 °C por 4 semanas, realizándose observaciones dos veces por semana.

2.4 Observación histológica

Los hámsteres tenían un mes de edad y fueron acondicionados en jaulas individuales con ventilación natural y cama de viruta en el bioterio de parasitología de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Escuela de Veterinaria de la Universidad Científica del Sur. En los hámsteres inoculados se evaluó el desarrollo de la enfermedad durante seis meses, de lunes a viernes, excepto sábados y domingos. Al final del sexto mes se tomaron muestras de biopsias a nivel hepático, pulmón, riñón y bazo de 1 cm², aproximadamente, para fijarlos en formol y hacer láminas para los estudios histopatológicos a través de coloración Hematoxilina/Eosina. En forma paralela, se utilizó un hámster como control positivo basado en la inoculación de una solución de 2,34 x 10⁶/ml de Leishmania (cepa JM) en cultivo Schneider y como control negativo se utilizó un hámster inoculado con una solución isotónica de cloruro de sodio al 0,9%. En ambos casos, se inoculó 0,5 ml en las almohadillas de las patas traseras y delanteras (2 ml total) y 0,5 ml vía intraperitoneal.

Las garrapatas colectadas de T. pecari (30 machos) y P. tajacu (28 machos) fueron clasificadas como Amblyomma naponense y las colectadas de C. denticulata (10 machos) se clasificaron como A. humerale.

En ninguna de las muestras observadas mediante microscopio óptico del pool de glándulas salivales y segmentos intestinales de las garrapatas se observaron tripanosomátidos excepto en la garrapata colectada accidentalmente de una persona en la que se encontraron tripanosomátidos en forma flagelada del pool de glándulas salivales y segmentos intestinales (Figura 1).

Figura 1. Coloración Giemsa de un extendido con vista directa al microscopio de la garrapata A. naponense colectada de una persona en el poblado de Botijon/Las Piedras visto a 400X donde se observa algunos flagelados.

Los cultivos fueron negativos para el crecimiento de algún tripanosomátido flagelado, aunque se encontró un hongo Fusarium y levaduras en la muestra de A. naponense colectado de Pecari tajacu (Figuras 2 y 3).

En los cortes histopatológicos de las muestras provenientes de tejido hepático y bazo de los hámsteres retados con la cepa JM de promastigotes de Leishmania sp mostraron edema sinuoso de leve infiltrado inflamatorio linfocitario distribuido en todo el parénquima y reacción inflamatoria, tipo pavimentoso concordante con Leishmaniasis respectivamente. Las evaluaciones de las demás muestras histológicas no fueron concluyentes.

Las garrapatas colectadas de T. pecari y P. tajacu fueron clasificadas como A. naponense y las colectadas de C. denticulata como A. humerale. Estudios previos han demostrado la distribución especies del género Amblyomma en animales silvestres como en Tapirus terrestres y C. denticulata de la selva de Madre de Dios en Perú (Del Valle et al., 2018; Esser et al.,2016; Rojas-Jaimes et al., 2021).

Figura 2. (a) observación directa a 400X de vísceras y glándulas salivales de A. naponense colectado de P. tajacu donde se observa levaduras. (b) cultivo vísceras y glándulas salivales de A. naponense colectados de P. tajacu vistas al microscopio a 400X donde se observa Fusarium sp.

Figura 3. Observación directa a 400X de cultivo de hígado de hámster retado con vísceras y glándulas salivales de A. naponense colectado de P. tajacu donde se observa levaduras.

En el presente estudio no se logró aislar Leishmania en cultivo de intestinos y glándulas salivales de las garrapatas ni se pudo identificar en la presencia del parásito en los hámsteres retados con los inóculos de los tejidos de las garrapatas, con excepción del control positivo con la cepa JM de Leishmania. No obstante, Campos et al. (2014) lograron causar infección por Leishmania en hámsteres inoculados con extractos de garrapatas Rhipicephalus sanguineus colectadas de perros. Si bien en el presente estudio no se identificó a Leishmania en A. naponensis y A humerale, Araúz et al. (2016) identificaron la forma de promastigote de Leishmania en glándulas salivales e intestinos de R. sanguineus.

Araúz, M., Guerrero. F., Miranda de Oliveira, B., Costa de Aquino, M., Hudson, S., Dias de Melo, G., Gomez, A., Takami, C., Garcia, M., Andreotti, R., Félix de Lima, V. & Saraiva, K. (2016). Identification of Leishmania spp. promastigotes in the intestines, ovaries, and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus actively infesting dogs. Parasitology Research, 115, 3479–3484.

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