Morfología
y morfometría
La
identificación clásica de las especies del género Meloidogyne se basa
principalmente en caracteres morfológicos y morfométricos. El procedimiento más
utilizado para la identificación de especies, era mediante el estudio del
patrón perineal en la región posterior del cuerpo de las hembras adultas (Kaur
& Attri 2012). Esta región incluye áreas como la de la vulva-ano (el
perineo) (Hunt & Handoo, 2009). Los padrones perineales de poblaciones de M.
incognita y M. javanica presentaron leves variaciones
morfológicas por la influencia de factores como el hospedante. Es por eso que
también se utilizan características morfológicas de la región cefálica y
estilete de la hembra, macho y segundo estadío juvenil; forma y tamaño de la
cola del segundo estadío juvenil (Eisenback & Triantophyllu, 1991). Sin
embargo, individuos del segundo estadío juvenil son suplementarios y
generalmente no se utilizan en la identificación rutinaria de especies
(Magunacelaya & Dagnino, 1999).
Debido a la
similaridad morfológica y morfo-métrica existente entre especies de Meloidogyne,
la forma más apropiada de realizar una caracte-rización es por medio de una
combinación de caracteres diferenciales de hembras, machos y juveniles de
segundo estadio (Carneiro & Cofcewicz, 2008). Pero en la diferenciación de Meloidogyne,
los caracteres morfológicos son más utilizados que los morfométricos, ya que
estos últimos pueden verse más afectados por las condiciones ambientales (Hunt
& Handoo, 2009).
Para poder
observar y medir las dimensiones de los nematodos fitoparásitos es necesario el
uso de equipos adecuados como el microscopio óptico, así como para poder
realizar fotografías o diagramas de sus estructuras. También se utiliza el
microscopio electrónico de exploración, como una herramienta de trabajo para el
diagnóstico, pues permite ver mucho más claramente algunos detalles
morfológicos que no pueden ser visualizados correctamente usando el microscopio
óptico compuesto; incluso permiten mostrar diferencias morfológicas entre
poblaciones o razas de diferentes especies; entre los más importantes
caracteres morfológicos revelados por el microscopio electrónico de exploración
se encuentran los de la región cefálica en las hembras, machos y juveniles, así
como detalles de las estructuras que ocurren en la cutícula y en la región de
la cola en hembras y machos (Rodríguez, 2000; Hartman & Sasser, 1985).
Identificación
por medio de isoenzimas
La técnica de
electroforesis de proteínas e isoenzimas consiste básicamente en que los
extractos proteicos solubles se separan en gel de poliacrilamida bajo campo
eléctrico de acuerdo con su masa molecular diferente (PAGE). La electroforesis
bidimensional en gel de poliacrilamida (2-D-PAGE) también puede utilizarse para
una mejor separación. En este caso, las proteínas se separan en la primera
dimensión de acuerdo con su punto isoeléctrico y en el segundo de acuerdo con
su masa molecular (Carneiro & Almeida, 2001). Los perfiles electroforéticos
de isoenzimas, particularmente EST esterasas y la malato deshidrogenasa MDH son
diferentes para cada especie (Silva et al., 2016). También se utilizan perfiles
de superóxido dismutasa SOD y glutamato-oxaloacetato transaminasa GOT (Karssen
& Moens, 2006, Blok & Powers, 2009).
La comparación
de perfiles electroforéticos de esterasas muestra una gran consistencia para
distinguir especies de Meloidogyne spp (Carneiro et al., 2005; Oliveira
et al., 2006; Steffen et al., 2007); sin embargo, los perfiles de malato
deshidrogenasa ayudan a identificar cuando los perfiles de esterasa son
similares, como, por ejemplo, con M. incognita y M. hapla.
Algunas especies, como M. arenaria, muestran varios perfiles
diferentes, aunque esto puede indicar la existencia de especies crípticas (Hunt
& Handoo, 2009).
En un trabajo
desarrollado por Esbenshade y Triantaphyllou (1985), se destacó el uso de
patrones de esterasa para diferenciar 16 especies de Meloidogyne, entre
las que se destacaron fenotipos de M. incognita, M. arenaria, M.
javanica y M. hapla. Por otro lado, en una investigacion hecha por
Carneiro et al. (2001) se utilizaron cuatro enzimas distintas (esterasa, malato
deshidro-genasa, superóxido dismutasa y glutamato oxaloacetato transaminasa)
para realizar la caracterización de más de 100 poblaciones originarias de
diferentes Estados de Brasil y países de América. Por lo tanto, fue posible
determinar 34 fenómenos enzimáticos para diferentes especies de Meloidogyne,
incluidos 18 fenotipos de esterasa, 6 de malato deshidrogenasa, 5 de superóxido
dismutasa y 5 de glutamato oxaloacetato transaminasa.
Identificación
molecular
La utilización
de técnicas moleculares para diagnósticos de diferentes especies de
fitopatógenos como los nematodos, ya sea por medio de análisis de ADN o
análisis de proteínas se ha incrementado en los últimos años, garantizando así
una mayor precisión en la identificación de las especies (Waele & Elsen,
2007). La identificación por medio del material genético es ventajosa debido a
que no está influenciada por las condiciones ambientales o por el estadio de
desarrollo del nematodo; es decir, la utilización de técnicas moleculares tiene
un gran potencial en la identificación rutinaria de nematodos (Al-Banna et al.,
2004).
Una de las
primeras técnicas utilizadas en identificación molecular fue el uso de
Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLPs), esta técnica es basada en el
estudio de Polimorfismos generados mediante el uso de Enzimas de restricción
como las endonucleasas que cortan el ADN en diferentes puntos, generando
fragmentos que son separados posteriormente por medio de electroforesis
(Becerra & Paredes, 2000), se ha utilizado esta técnica para diferenciar
poblaciones de M. arenaria raza 2, cuando la identificación
morfológica fue insuficiente, permitiendo diferenciar las poblaciones en
muestras de hasta 30 nematodos (Carpenter et al. 1992), de la misma forma se ha
utilizado de forma combinada con estudios de fenotipos de esterasas para
identificación de Meloidogyne (Fargette et al. 1996).
En la actualidad, los métodos moleculares basados en PCR para la
identificación de las especies de Meloidogyne, incluyen el uso de
regiones objetivas tales como: mtDNA (ADN mitocondrial) (Tigano et al., 2005;
Powers et al., 2005), rDNA (ADN ribosómico) (Zijlstra et al. 1997; Saeki et
al., 2002; Monteiro, 2016), región IGS (espaciador intergénico) (Wishart et al.
2002) y secuencias de los genes 18S, 5.8 y 28S del rDNA. Los métodos incluyen
el uso de RFLP (Xu, et al., 2004), RAPD (Amplificación aleatoria de ADN
polimórfico) (Tigano et al., 2010), sondas de microsatélites y ADN satélite,
PCR multiplex (Saeki et al., 2002), iniciadores específicos SCAR (Zijlstra et
al., 2000; Tigano et al., 2010; Jorge, 2016; Mattos, 2017) y PCR en tiempo real
(Toyota et al. 2008; Agudelo et al., 2011; De Weerdt et al., 2011; Sapkota et
al., 2016).
Técnicas como
PCR multiplex son muy útiles en la identificación de varias especies de forma
conjunta, debido a que este tipo de procedimientos permiten amplificar varios
segmentos de ADN, en una sola reacción por medio del uso de dos o más sets de
iniciadores (Bolívar et al. 2014), esta técnica ha sido ampliamente empleada
para la identificación y detección de M. incognita, M. enterolobii,
M. javanica y M. arenaria (Hu et al. 2011; Devran et al.
2018; Wolf et al. 2013), usando ADN extraído de agallas provocadas por el
nematodo en China y Turquía, así como en países del sudeste europeo, con la
finalidad de desarrollar un método rápido de identificación. Este tipo de
técnica ha sido utilizada en la identificación de Meloidogyne spp., y Pratylenchus
spp., mediante el uso de iniciadores específicos, a partir de muestras de suelo
donde existen la presencia de otros nematodos (Saeki et al. 2003).
La PCR
convencional es un método de detección cualitativo, mientras que la PCR en
Tiempo Real (Real Time PCR), se caracteriza en ser un método de detección pero
que en forma simultánea cuantifica el producto amplificado por medio de la
emisión de fluorescencia que es interpretada por un lector acoplado al
termociclador (Cunha et al., 2018). Empleando esta técnica, De Weerdt et al.
(2010) desarrollaron un método para la identificación de M. minor
a partir de ADN de un J2 en presencia de 10 poblaciones de seis especies de
nematodos de las agallas. Así mismo Sapkota et al. (2016) identificaron M.
hapla de raíces y suelo provenientes de un cultivo de zanahoria de
campos infestados en Dinamarca. Otras especies tales como: M. incognita,
M. enterolobii, M. javanica, M. graminícola
han sido identificadas por medio de PCR en tiempo Real, ya sea solas o en
muestras donde existe la presencia de otros nematodos fitopatógenos como Globodera
rostochiensis, Pratylenchus zeae y Xiphinema elongatum (Kiewnick,
Frey & Braun-Kiewnick, 2015;(Zhao et al., 2010; Toyota., 2008; Nguyễn
et al., 2014; Berry et al., 2008).
Los métodos más
recientes basados en PCR convencional usaron primers que son
capaces de distinguir especies sin una etapa de digestión posterior (Kumar
& Gurusubramanian, 2011), describieron la técnica RAPD (Amplificación
aleatoria de ADN polimórfico) como una técnica utilizada para identificar la
variación genética entre poblaciones de organismos por medio de la detección de
polimorfismos; los marcadores moleculares RAPD se obtienen después de la
amplificación por PCR de segmentos aleatorios del ADN, utilizando secuencias
arbitrarias o no específicas de oligonucleótidos iniciadores. (Williamson et al.,
1997. De la misma forma, Abd et al. (2019) sintetizaron y evaluaron primers de
PCR derivados de las secuencias de RAPD en poblaciones de nematodos.
La técnica RAPD,
fue utilizada años más tarde por Zijlstra et al. (2000), que usaron los
marcadores específicos OPA-l2420, OPB-061200, OPA-OI700, mediante el
secuenciamiento de esas regiones génicas, fueron identificados individuos de M.
chitwoodi, M. fallax, M. hapla, M. incognita,
M. javanica y M. arenaria, a partir de muestras
colectadas principalmente en regiones tropicales y subtropicales. Por otro
lado, en muestras colectadas en plantaciones bajo el sistema cultivo protegido,
fueron analizadas muestras de ADN extraídas de masas de huevos, J2 y hembras,
para la identificación precisa de M. incognita, M. javanica,
M. arenaria, M. mayaguensis, M. hapla,
M. chitwoodi y M. fallax en combinación con
marcadores de tipo Scar (Adam et al., 2007).
Los marcadores
SCARs, son una de las herramientas moleculares más efectivas y precisas usadas
para la identificación de microorganismos (Lee et al., 2013). Un SCAR es un
fragmento de ADN genómico en un solo locus, genéticamente definido que es
identificado por amplificación por PCR usando un par de iniciadores
específicos, generalmente de 15 a 30 pares de bases (Paran & Michelmore,
1993). Los marcadores de SCAR presentan ventajas sobre los marcadores RAPD
porque su amplificación por PCR es menos sensible a la condición de reacción
(Paran & Michelmore, 1993; Bautista et al., 2002). Además, la amplificación
por PCR de los SCARs es reproducible y puede ser fácilmente detectada. Por lo
tanto, el análisis usando marcadores SCAR es simple, rápido y fácil de ejecutar
(Yuakianti & Shiraishi, 2010).
Otra técnica
empleada es AFLP, Fragmentos Polimórficos Amplificados al Azar, en esta técnica
se basa en la amplificación por PCR de fragmentos que originados por enzimas de
restricción, de esta forma se combinan los fundamentos de las técnicas RFLP y
PCR, al igual que RAPD es de herencia dominante y ha sido utilizada ampliamente
para caracterizar la diversidad genética de fitopatógenos (Becerra &
Paredes, 2000; Mayer et al., 2010; Dos Santos et al. 2013; Casanovas et al.
2013; Rocha et al. 2015). como para analizar la diversidad genética de
poblaciones de M. chitwoodi y M. fallax, donde se
demostró la presencia de diversos grupos poblacionales de estos
nematodos(Fargette et al., 2005), así mismo se ha utilizado esta técnica en
combinación con marcadores RAPD, demostrando que la diversidad de poblaciones
de M. incognita provenientes de cultivos de algodón en el estado
de Bahía no se encuentra relacionada con la virulencia en relación a accesiones
resistentes, lo que podría deberse a la presencia de 1 o 2 genes de resistencia
en estos cultivares (Lopes et al., 2019)
Existen otras
técnicas para la identificación molecular de Meloidogyne como la técnica
LAMP (Amplificación isotérmica de ADN mediada por asas), que puede amplificar
grandes cantidades de ADN con gran precisión, en un tiempo corto y además como
es isotérmica puede realizarse a una sola temperatura estable, lo que resulta
en que no necesita del uso del termociclador y los productos que derivan de la
reacción pueden ser observados a simple vista en tubos de reacción, empleando
colorantes de ligación al ADN (Mori & Notomi, 2009). Esta técnica ha sido
empleada para amplificar segmentos genéticos como el espacio intergénico
IGS2-18S, 5S, ITS del rDNA para la correcta y precisa identificación de M.
chitwoodi, M. enterolobii y M. hapla (Niu et
al., 2012; Peng et al., 2017).
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http://orcid.org/0000-0003-3785-7457 