Diversidad de especies nativas de Halomonas con capacidad nitrificante aisladas de criaderos de Litopenaeus vannamei

Diversity of Halomonas native species to have nitrifying capability isolated from Litopenaeus vannamei farm

Silvana Pérez Tejeda¹; Melissa Rojas Suárez¹; Gardenia Prado Chávarri²; David Zavaleta-Verde^{1, *}

1  Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo, Av. Juan Pablo II s/n – Ciudad Universitaria, Trujillo, Perú.

2  Universidad César Vallejo, Av. Larco 1770, Trujillo, Perú.

* Autor corresponsal:  ezverde@unitru.edu.pe (D. Zavaleta-Verde).

ID ORCID de los autores

S. Pérez Tejeda: https://orcid.org/0000-0001-6851-3943                M. Rojas Suárez: https://orcid.org/0000-0002-3855-1989

G. Prado Chávarri: https://orcid.org/0000-0002-2089-3200            D. Zavaleta-Verde: https://orcid.org/0000-0003-0382-8420

RESUMEN

El objetivo de la investigación fue identificar cuáles son las especies del género Halomonas, con capacidad nitrificante, aisladas de sedimentos de criaderos de Litopenaeus vannamei provenientes de langostineras de Tumbes-Perú. A partir del sedimento de 3 criaderos de langostinos en tiempo de cosecha, se obtuvo una muestra representativa, a la cual se realizó un pre-enriquecimiento en Caldo Marino por 48 horas, luego se cultivó en Agar Marino, hasta la observación de colonias características del género Halomonas. Los cultivos obtenidos fueron identificados fenotípicamente a nivel de especie, para luego evaluar su capacidad nitrificante según la metodología de Griess-llosvay. Como resultados se obtuvo el aislamiento de 5 cultivos bacterianos, dos identificados como H. sulfidaeris y 3 como H. salina; todos los cultivos evidenciaron capacidad de reducir el nitrato a nitrito eliminando el amonio del medio. Se concluye que en el sedimento de criaderos de Litopenaeus vannamei ubicadas en Tumbes-Perú, están presentes las especies H. sulfidaeris y H. salina, con capacidad nitrificante, que permiten la eliminación del amonio, la cual se desarrolla como una opción eficaz para el tratamiento de agua residuales salinas de amonio.

Palabras clave: Halomonas sulfidaeris; Halomonas salina; Litopenaeus vannamei; aguas residuals.

ABSTRACT

The objective of the research was to identify the species of the genus Halomonas, with nitrifying capacity, isolated from sediments of Litopenaeus vannamei farms from shrimp farms in Tumbes-Peru. From the sediment of 3 prawn farms at harvest time, a representative sample was obtained, to which a pre-enrichment was carried out in Marine Broth for 48 hours, then it was cultured in Marine Agar, until the observation of colonies characteristic of the genus Halomonas. The cultures obtained were identified phenotypically at the species level, to then evaluate their nitrifying capacity according to the Griess-llosvay methodology. As results, the isolation of 5 bacterial cultures was obtained, two identified as H. sulfidaeris and 3 as H. salina; All cultures showed the ability to reduce nitrate to nitrite by eliminating ammonium from the medium. It is concluded that in the sediment of Litopenaeus vannamei breeding sites located in Tumbes-Peru, the species H. sulfidaeris and H. salina are present, with nitrifying capacity, which allow the elimination of ammonium, which is developed as an effective option for the saline ammonium wastewater treatment.

Keywords: Halomonas sulfidaeris; Halomonas salina; Litopenaeus vannamei; sewage.

Recibido: 16-09-2023.

Aceptado: 11-12-2023.

INTRODUCCIÓN

Dentro del grupo de bacterias halófilas y halotolerantes se encuentran especies del género Halomonas (Le Borgne et al., 2008), bacterias Gram negativas, heterotróficas, de rápido crecimiento y tolerantes a los ambientes salinos (Kim et al., 2013). Según varias investigaciones realizadas se aislaron especies de Halomonas en plantas marinas (Bibi, 2016), lagos salinos (Singh et al., 2018; Ming et al., 2020; Mamani et al., 2019), llanura costera (Koh et al., 2017), sedimento del Océano Índico, (Qiu et al., 2021), suelo salino (Li et al., 2022; Gan et al., 2018), piscina de minerales (Romano et al., 2019), desiertos (Hintersatz et al., 2023; Patel, & Thaker, 2015), reservorios de petróleo (Mnif et al., 2009), efluentes provenientes del procesamiento del olivo (Liebgott et al., 2008), efluentes prove-nientes del procesamiento de licor (Yang et al., 2010), minas de sal (Cardinali-Rezende et al., 2016), criaderos de Palaemon serratus “camaro-nes” (Xue et al., 2018), y de Litopenaeus vannamei (Kasan et al., 2017).

L. vannamei, conocido como “camarón blanco”, es nativo de la costa oriental del Océano Pacifico, México (ciudad de Sonora) hasta Perú (ciudad de Tumbes), se encuentran en hábitats marinos tropicales. En las etapas juvenil, adolescente, pre-adulta y adulta la desarrollan en estuarios, lagunas costeras y manglares, su tiempo de cosecha es entre 6 y 7 meses (FAO, 2006). Sin embargo, uno de los problemas principales que afecta la producción de estos, es la toxicidad debido a los residuos de alimentación y los desechos orgánicos que producen niveles altos de amonio en solución (Duan et al., 2021).

Una alternativa para el tratamiento de aguas residuales salinas de amonio es el uso de especies de los géneros bacterianos Nitrosomonas, Nitroso-cococcus, Nitrococcus, Nitrospira y Nitrobacter (Yuan et al., 2022; Paungfoo et al., 2007), por su capacidad nitrificante. En investigaciones se ha evaluado la actividad de H. indigenous (Sangnoi et al., 2017), H. boliviensis (Quillaguamán et al., 2004), H. zhanjiangensis (Chen et al., 2009), H. campisalis (Guo et al., 2013) así como también la halotolerancia de H. salifodinae con capacidad de nitrificación heterotrófica y desnitrificación aeróbica (Hu et al., 2022).

El tratamiento de aguas residuales generadas en los criaderos de L. vannamei, es dificultoso, debido a las condiciones extremas que da las concentraciones de sal, y que impiden la nitrificación de bacterias comunes (Sangnoi et al., 2017); en ese sentido, la aplicación de especies halófilas y halotolerantes es recomendado antes que el tratamiento físico-químico, que es una opción muy frecuente (Huan et al., 2021).

El amonio es un compuesto tóxico del nitrógeno causante de la disminución en la tasa de producción, en cuanto, a la densidad de L. vannamei; además la presencia de altas concentraciones de sal, disminuyen el rendimiento del proceso biológico para la eliminación del nitrógeno. Por tal motivo, es justificable haber realizado la investigación para el hallazgo de especies de Halomonas tolerantes a ambientes con altas concentraciones de sal, además de la capacidad nitrificante que presentan, siendo así eficaz para el tratamiento de aguas residuales salinas contaminadas con amonio.

El objetivo de la investigación fue identificar cuáles son las especies del género Halomonas, con capacidad nitrificante, aisladas de sedimentos de criaderos de Litopenaeus vannamei provenientes de langostineras de Tumbes-Perú.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de muestra

Se muestreo dos langostineras (EXAPAL SRL y MACORI SRL) ubicadas en la ciudad de Tumbes- Perú, en las cuales se realizó un muestreo dirigido, obteniéndose 3 muestras de sedimento, de 3 criaderos en tiempo de cosecha; de cada criadero se eligieron 5 puntos y se colectaron 50 g que luego se mezclaron para constituir una sola muestra. Los criaderos en promedio tuvieron un área de 3,4 ha cada uno, y registraron valores promedio de pH del agua 7,7 ± 0,3, pH del sedimento 7,2 ± 1, densidad poblacional 10 langostinos/m², porcentaje de salinidad de 26% y temperatura de 26,3 ± 1 °C (Guan et al., 2020). Las muestras fueron etique-tadas y transportadas al laboratorio en un cooler refrigerado a 4 °C.

Pre-enriquecimiento del sedimento muestreado

Se homogenizó la muestra y se agregaron 25 g (Vreeland, 2015) en un matraz con 250 mL de Caldo Marino estéril. Se incubaron a 20±2 °C por 48 horas (Yang et al., 2010) a 120 rpm (Vreeland, 2015). Se realizó el mismo procedimiento con las demás muestras de cada criadero.

Aislamiento primario

Se realizaron diluciones en serie hasta 10^-10 utilizando agua salina artificial (NaCl 5 %, p/v) (Guan et al., 2020). De las diluciones se inocularon por superficie en placa de Petri con Agar Marino, se incubaron (Memmert SN-55) a 30 °C por 2 días (Yang et al., 2010). Este procedimiento se realizó para cada una de las muestras.

Luego, se seleccionaron aquellas colonias con las siguientes características: pigmentación blanca, marrón claro, beige-crema, amarillo-anaranjado, con bordes circulares lisos, brillantes u opacas. A estas colonias se les realizó la técnica de gram, teniéndose en cuenta los siguientes criterios: bacilos Gram negativos, cortos o largos, rectos o curvos (Mata et al., 2002).

Se codificaron las colonias seleccionadas y se cultivaron por estría en placas de Petri estériles con Agar Marino al 10 % de salinidad con un pH de 8 ± 1. Se incubaron a 30 °C por 48 horas. Se verificó la pureza mediante coloración Gram.

Identificación fenotípica de especies de Halomonas

Los cultivos puros fueron cultivados en placas de Petri con Agar Marino al 1,9% de salinidad. Se incubaron a 30 °C por 48 horas. Se realizaron pruebas fenotípicas, siguiendo la metodología sugerida descrita en el Manual de Sistemática de Arqueas y Bacterias Bergey’s (Vreeland, 2015), tales como: reacción Gram, morfología, pigmentación, motilidad, producción de H₂S, catalasa, oxidasa, producción de ácidos a partir de glucosa, maltosa, manosa, sacarosa, galactosa, crecimiento en citrato, producción de indol, hidrólisis de urea, almidón, esculina, tween 80, ADN, rango de NaCl (%, w/v) (Mata et al., 2002; Kaye et al., 2004).

Evaluación cualitativa de la capacidad nitrificante de las especies de Halomonas

Los cultivos de Halomonas aislados, fueron sub-cultivados en caldo péptido extracto de carne de vacuno al 10% de inoculo, e incubados a 30 °C y 150 rpm. Luego de 3 días de incubación, el consumo de amonio fue evaluado por el método de Griess-llosvay. En 1 mL del medio de cultivo, se añadieron de 5-7 gotas del reactivo de nitrito. Una reacción positiva se evidenció por el cambio del color del medio a rosado (Sangnoi et al., 2017).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los ambientes salobres como es el caso de los criaderos de langostinos presentan las condiciones necesarias para el desarrollo de bacterias halófilas del género Halomonas, los cuales según estudios realizados (Abosamaha, et al., 2022; Agha et al., 2018), se identificaron estas especies en criaderos de Litopenaeus vannamei.

A partir de la muestra del sedimento de criaderos de L. vannamei, se aislaron 5 cultivos bacterianos. Identificados fenotípicamente, según las caracte-rísticas presentadas en estudios científicos de investigación (Ye & Chen, 2021). Todos los cultivos aislados fueron bacilos Gram negativos, con características de colonias como: pigmentación beige-crema, bordes circulares lisos, brillantes en cultivos de 48 horas a 30 °C en agar Marino al 10% de salinidad.

Las características fenotípicas diferenciales de las especies de Halomonas aisladas, se describen en la Tabla 1.

Tabla 1

Características diferenciales fenotípicas de especies nativas de Halomonas aisladas de sedimento de las langostineras de Tumbes, Perú

Características	Especies Nativas
	H. sulfidaeris Ha09	H. sulfidaeris Ha10	H. salina Ha33	H. salina Ha35	H. salina Ha38
Lugar de procedencia	Langostinera EXAPAL SRL	Langostinera EXAPAL SRL	Langostinera MACORI SRL	Langostinera MACORI SRL	Langostinera MACORI SRL
Motilidad	+	+	-	-	-
Oxidasa	+	+	+	+	+
Catalasa	+	+	+	+	+
Ureasa	-	-	+	+	+
Producción de H2S	-	-	-	+	+
Indol	-	-	-	-	-
Citrato	-	-	-	-	-
Rango NaCl (%, w/v)	0,5-25	0,5-25	0,5-15	0,5-15	0,5-15
Hidrólisis de
Almidón	-	-	-	-	-
Tween 80	-	-	-	-	-
Esculina	-	-	-	-	-
DNA	-	-	-	-	-
Producción de ácidos a partir de
Sacarosa	-	-	-	-	-
Glucosa	+	+	-	-	-
Maltosa	+	+	-	-	-
Manosa	+	+	-	-	-
Galactosa	+	+	-	-	-

+, positivo; -, negativo.

El género Halomonas es un grupo que se encuentra en ambientes con moderada a elevada concen-traciones de sal (Ming et al., 2020; Manya et al., 2021). El crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl permitió diferenciar las especies de Halomonas, en el caso de H. sulfidaeris crece en un rango de 0,5% - 24% de NaCl (Ahmad et al., 2023; Saito, 2019), los cultivos codificados como Ha09 y Ha10 presentaron crecimiento dentro de este rango. En el caso de H. salina su crecimiento tolera entre 0,5% - 15% de NaCl (Saito, 2019; Ahmad et al., 2023) rango en el cual crecieron los cultivos Ha33, Ha35, Ha38. También otras pruebas diferenciales que se evaluaron para identificar las especies de H. sulfidaeris y H. salina fueron necesarias para su diferenciación.

H. sulfidaeris presenta movilidad debido a la presencia de flagelos peritricos (Ahmad et al., 2023), como el caso de los cultivos aislados Ha09 y ha10 el cual presentaron estas características. H. salina no presenta movilidad, Ha33, Ha35 y Ha38 tienen esta característica.

En cuanto a la producción de ácidos a partir de azúcares como: sacarosa, glucosa, maltosa, manosa y galactosa, la especie H. sulfidaeris produjo ácidos a partir de todos los azúcares excepto sacarosa (Qiu et al., 2021; Ahmad et al., 2023), mientras que la especie H. salina no presentó esta característica en ninguna de estos azucares (Mata et al., 2002), lo cual, concuerda con los resultados obtenidos en la investigación.

En cuanto a la producción de H₂S para la especie de H. salina fue variable (Hintersatz et al., 2023), solo los cultivos Ha35 y Ha38 presentaron producción de H₂S.

Según estudios reportados algunas especies del género Halomonas presentan capacidad nitrifi-cante (Lui et al., 2020). Se ha descrito que H. sulfidaeris y H. salina reducen nitrato a nitrito eliminando el amonio por lo cual presentan esta capacidad (Vreeland, 2015; Lui et al., 2020), corroborando los resultados obtenidos ya que todos los cultivos evaluados cualitativamente mostraron capacidad nitrificante.

Este estudio podría ayudar a desarrollar a las especies de Halomonas como opción para el tratamiento de aguas residuales salinas de amonio en langostineras de L. vannamei

CONCLUSIONES

Esta investigación ha reportado el aislamiento de las especies nativas del género Halomonas. Estas especies son H. sulfidaeris y H. salina, con capacidad nitrificante aisladas de sedimentos de criaderos de Litopenaeus vannamei ubicadas en Tumbes-Perú. Las dos especies presentaron características fenotípicas del género, así como   la confirmación de la capacidad nitrificante que determina que la eliminación del amonio la cual se desarrolla como una opción eficaz para el tratamiento de agua residuales salinas de amonio.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a las langostineras EXAPAL SRL y MACORI SRL ubicadas en la ciudad de Tumbes- Perú que permitieron la recolección de muestras.

Agradecen también a los revisores pares y a los editores de esta revista por sus comentarios, que ayudaron a mejorar este trabajo.

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