Perú es uno de los principales países exportadores de cacao (Theobroma cacao) de América Latina y el segundo exportador de cacao orgánico a nivel mundial (Charry et al. 2023). Sin embargo, a partir de enero del año 2019 este sector se vio gran-demente afectado por la vigencia del nuevo reglamento de la Unión Europea (UE) Nº488/2014, en el cual se redujeron los límites máximos permi-sibles de cadmio en varios productos alimenticios, incluyendo los productos derivados del cacao.

El cadmio (Cd) es uno de los metales pesados más comunes presentes en el suelo, que puede acu-mularse continuamente en la cadena alimentaria y, de forma consecuente, amenazar la salud humana (Dai et al. 2024). La principal problemática del cultivo relacionado a este metal es que la planta de cacao lo concentra en demasía; acumulándolo principalmente en sus frutos. Se ha reportado una mayor bioacumulación de Cd en la variedad nativa, que sobrepasa los límites máximos permitidos (Tuesta, 2022).

En estudios realizados a muestras de fruto de cacao de diversas zonas del Perú, se determinó que las regiones con los niveles más altos de cadmio fueron Amazonas, Piura, Tumbes y algunos sectores de Huánuco (Alliance Bioversity & CIAT, 2020).

En las últimas décadas, se ha evaluado diferentes técnicas para reducir el contenido de cadmio en el fruto del cacao y sus derivados. Las técnicas convencionales consisten en la remoción o bloqueo del Cd de los suelos mediante enmiendas, biochar, regulación de pH, entre otros (Meter et al., 2019). Dentro de las alternativas con mayor potencial resaltan las técnicas de fitorremediación, el uso de plantas para eliminar, reducir o transformar ele-mentos contaminantes y las técnicas de biorre-mediación que utilizan organismos o microor-ganismos para degradar compuestos contaminan-tes; por ser opciones más prácticas, económicas y amigables con el medio ambiente (Pérez, 2020).

Diferentes especies de plantas mostraron un potencial de fitorremediación (Guzmán-Castro et al., 2022) siendo la especie Ricinus communis o comúnmente conocida como Higuerilla una de las más prometedoras para la remoción de metales pesados (Saidu et al., 2022).

R. communis es una planta de gran distribución geográfica, poco exigente al tipo de suelo, de rápido crecimiento y que además produce frutos que pueden ser utilizados en la producción de aceite (Tierra, 2022). Estudios anteriores mostraron que R. communis acumula el Cd principalmente en sus raíces y transloca de manera muy limitada el metal en sus frutos y hojas (Bauddh et al., 2016); la siembra de higuerilla en campos contaminados por este metal permitiría extraer el Cd además de producir un fruto de valor agregado.

Dentro del ámbito de la biorremediación, algunos géneros bacterianos son esenciales para la fertili-zación de los suelos ya que participan en los ciclos de nutrientes mediante la descomposición de la materia orgánica, la fijación de nitrógeno (N) y la solubilización de diferentes elementos como el fósforo (P), potasio (K), minerales y microelemen-tos (Marco et al., 2024). Además, las bacterias participan en la biodegradación de contaminantes mediante mecanismos de quelación, biosorción y promueven el crecimiento de las plantas, princi-palmente en la parte radical (Santoyo de la Cruz et al., 2023).

Los suelos contaminados con Cd pueden verse afectados en su diversidad microbiana, por ello es vital explorar bacterias resistentes o tolerantes a este metal y que a la vez presenten características de promoción de crecimiento vegetal (PGPR) para que puedan complementar a las especies de interés fitorremediador. Por tal razón, en este estudio se evaluó la capacidad de eliminación del Cd de suelos cacaoteros mediante la siembra de R. communis y por la adición de bacterias nativas PGPR aisladas a partir de suelos contaminados con Cd. La adición de bacterias permitió la biorremediación y reforzar el crecimiento vegetal.

Bacterias promotoras de crecimiento vegetal

Para determinar si las bacterias seleccionadas tenían la capacidad de promoción de crecimiento vegetal se utilizó el medio agar NBRIP (fosfato), medio agar BSK (potasio) y medio líquido ASBHY (nitrógeno). Para el caso de las bacterias solubili-zadoras de fosfato (P) y potasio (K), la selección de las cepas se realizó mediante el método de disco en placa y esta se basó en la medición de sus halos mediante el índice de solubilización (IS), selec-cionando aquellas que presenten un índice ≥ 2 mm. En cambio, en el caso de las bacterias fijadoras de nitrógeno (N), se consideraron aquellas que mostraron crecimiento celular mediante la medición de densidad óptica (OD 600) durante 48 h, eligiendo aquellas por encima de 0,5 de OD.

Identificación de las cepas bacterianas

Las cepas seleccionadas fueron identificadas por secuenciamiento parcial del gen 16S ARNr. Para ello se realizó el proceso de extracción y cuantificación del ADN bacteriano utilizando el protocolo PBS descrito por Deza et al. 2016; seguido de la PCR dirigida a la amplificación del gen 16S ARN ribosomal con los primers universales 27-F y 1492-R y finalmente la visualización del producto de PCR por electroforesis. Los amplicones obtenidos de estas bacterias, se enviaron a secuenciar a la empresa MACROGEN USA. El análisis bioinformático de las secuencias se realizó utilizando los softwares MEGA 11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11 (Tamura, Stecher & Kumar, 2021) y NCBI-Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Formulación de consorcios

Posteriormente, para realizar el último filtro de selección de las mejores cepas bacterianas se realizó una prueba de compatibilidad y/o anta-gonismo, para descartar uno de los principales problemas que presentaría la futura inoculación, la inhibición entre las cepas bacterianas. Para ello, se siguió la metodología de detección con sensi disco de Pérez et al. (2014).

Se efectuó un sembrado masivo de 25 µl de cada bacteria a una dosis de 8x10⁸ UFC/ml, se deposi-taron discos de papel filtro estériles de 6mm de diámetro, los cuales fueron inoculados con 10 µl de cada una de las cepas a enfrentar; estos fueron colocados en la caja Petri de manera radial. Por último, las placas fueron incubadas a 37 °C por 72 horas, realizándose una lectura cada 24 horas. Reportándose aquellas que crecían con normali-dad, así como aquellas que presentaran un halo de inhibición o no crecimiento y formulándose la mejor combinación de bacterias como el consorcio a trabajar.

Masificación de bacterias

Para este experimento se utilizaron los medios LB y melaza al 2%. Primero se reactivaron las cepas añadiendo 100 μl de bacteria en 900 μl de caldo LB, se dejan en crecimiento en el shaker a 37 ^°C con 130 rpm por 24 h. Consecutivamente el cultivo bacte-riano obtenido en 1 ml se añade a 9 ml de caldo LB. Posteriormente los 10 ml se añaden a 90 ml de caldo LBB, en cada paso se repite el crecimiento bacteriano con las mismas condiciones por 24 h. Luego, los 100 ml obtenidos se añaden a 400 ml de melaza diluida al 2% y se deja en crecimiento por el mismo periodo de tiempo. Se traspasan a un volumen total de 1 litro y finalmente a 5 litros, el cual corresponde individualmente a cada cepa bacteriana. También se deben tener en cuenta las condiciones de pH y nivel de OD.

Suelo experimental

El suelo experimental fue extraído de la parcela agrícola con código S1 (Tabla 1) de la asociación APRONATIVOS del departamento de Amazonas, que fue analizado en el muestreo inicial. La cantidad colectada corresponde a los 30 cm de la capa superior del suelo.

La determinación del contenido de Cd en el suelo se determinó mediante el método EPA 6020A y se obtuvo como resultado 1,043 ppm. Este es un valor relativamente alto y cercano al dato establecido en el Estándar de Calidad Ambiental para uso de suelo agrícola (1,4 ppm de Cd).

Cálculo del suelo para el plan experimental

Se dispuso de 3 tamaños de macetas para las 3 evaluaciones propuestas (1.^er, 2.^o y 3.^er mes). La capacidad de las macetas fue de 1 kg, 15 kg y 35 kg de suelo respectivamente.

Se formuló 3 grupos experimentales: G1 (Ricinus), G2 (Ricinus + consorcio bacteriano) y G3 (consorcio bacteriano). Se consideraron 3 tratamientos que correspondían a las 3 concentraciones de cadmio 1,043 ppm (suelo natural), 2,5 ppm y 5 ppm.

Se realizó el diseño experimental en 90 macetas con un total de 1530 kg de suelo, divididos en 510 kg de suelo por concentración de Cd.

Cálculo de adición de Cd para cada tratamiento

Se disolvió 0,93 g y 2,52 g de cloruro de cadmio (CdCl₂) al 80% en 5 L de agua para obtener el 2do tratamiento (2,5 ppm de Cd) y 3er tratamiento (5 ppm de Cd) respectivamente. La adición de Cd al suelo se realizó mediante aspersión en botellas rociadoras para obtener una mezcla homogénea. El suelo fue removido interdiariamente por dos semanas; luego, una muestra de suelo fue enviada a analizar para verificar la concentración final de los tratamientos.

Establecimiento del experimento

El experimento se realizó con 3 repeticiones de cada tratamiento y de cada concentración más un grupo control. Una vez colocado el suelo en las macetas, las semillas fueron esterilizadas con hipoclorito de sodio al 0,5% por 30 min y luego enjuagadas tres veces con agua destilada estéril. Seguidamente las semillas fueron colocadas en los tratamientos correspondientes a una profundidad de 3 cm. De la misma forma, el consorcio bacteriano fue añadido a los tratamientos correspondientes en una proporción de 400 ml/25 kg de suelo (Liu et al. 2018). El establecimiento del experimento se resume en la Figura 2.

Resultados del muestreo y selección de las mejores cepas bacterianas

Según los datos obtenidos en la Tabla 1, se denota que los niveles de Cd fueron mayores en los granos de cacao que en el suelo del cual la planta obtiene el contaminante, presentándose un incremento del 89,18% en la muestra S1, un 221,49% en la muestra S2 y un 188,18% en la muestra S3.

La concentración de Cd en las muestras de suelo no supera el dato establecido en el Estándar de Calidad Ambiental para uso de suelo agrícola (1,4 ppm de Cd); sin embargo, la concentración de Cd en las muestras de fruto de cacao si superan el rango permitido en el reglamento N^o 488/2014 de la Unión Europea para los productos específicos de cacao, que va desde 0,1 ppm hasta 0,8 ppm.

El primer filtro de selección del proceso consistía en que las bacterias escogidas tuvieran los valores óptimos en cada uno de los 3 medios selectivos de crecimiento. Para los medios NBRIP y BSK se escogieron las bacterias con un índice de solubilización (IS) ≥ 2 cm (a excepción de la cepa AS1A1 que no cumple con un valor, pero tiene el mayor IS en el medio NBRIP) y para el medio ASBHY aquellas que reporten más de 0,5 de OD. Teniendo un total de 13 bacterias, 11 bacterias en el primer grupo (muestras de suelo cacaotero) y 2 bacterias en el segundo grupo (muestras de suelo de Ricinus).

Se realizó la identificación molecular de las 13 bacterias seleccionadas previamente (Tabla 2), obteniendo un 76,92% de identificación hasta el nivel de especie, un 7,69% de identificación hasta el nivel de familia y un 15,38% que no se logró identificar debido a que los resultados presentaban un bajo porcentaje de identidad (Tabla 3).

Tabla 2

Bacterias seleccionadas según resultados en medios de crecimiento vegetal. Muestras AS1A1-AS3C24 provienen de suelos cacaoteros de Amazonas, RB7-RB8 fueron aislados de la Rizosfera de Ricinus communis de Tumbes

Código Final	IS (48 h)		OD 600 ASHBY
Código Final	NBRIP	BSK	OD 600 ASHBY
AS1A1	6,2	1,5	0,820
AS1A4	3,4	2,8	0,633
AS3A12	3,4	2,7	0,871
AS1C13	4,1	3,0	0,707
AS2C14	3,7	2,6	0,948
AS2C15	5,1	3,9	2,679
AS2C16	3,6	2,8	1,001
AS2C17	3,9	3,2	0,971
AS2B19	4,9	4,4	0,875
AS3C23	4,9	4,9	1,001
AS3C24	4,7	3,6	1,041
RB7	2,8	2,2	0,775
RB8	2,4	2,4	0,822

Tabla 3

Resultados del secuenciamiento molecular

Código Bacteriano	Identificación	Identidad
AS1A1	Klebsiella aerogenes	99,40%
AS1A4	Escherichia coli	99,80%
AS2C12	Serratia marcescens	99,67%
AS1C13	Pseudomonas aeruginosa	99,40%
AS2C14	Porcentaje no admitido	90,27%
AS2C15	Enterobacter aerogenes	99,66%
AS2C16	Yersiniaceae	95,25%
AS2C17	Porcentaje no admitido	80,61%
AS2B19	Burkholderia contaminans	99,32%
AS3C23	Enterobacter sp.	99,66%
AS3C24	Klebsiella aerogenes	99,33%
RB7	Klebsiella aerogenes	99,73%
RB8	Bacillus aryabhattai	99,80%

Elección del consorcio bacteriano

No se presentaron casos en los que existieran halos de inhibición; sin embargo, el hecho de que algunas bacterias no mostraran crecimiento también denota una forma de incompatibilidad.

Luego de realizarse todas las combinaciones el consorcio elegido según esta prueba de compa-tibilidad, así como por los valores presentados en las pruebas previas, lo constituyen los siguientes códigos bacterianos:

RB7, AS1A1, AS1C13 y AS2C17

Resultados de concentración de Cd en los tratamientos

Los resultados de la concentración de Cd en los tratamientos fueron los siguientes: T1 (1,02 ppm de Cd), T2 (1,64 ppm de Cd) y T3 (2,2 ppm de Cd). Por tanto, esos fueron los valores base asumidos para realizar las mediciones durante el periodo de evaluación del experimento.

Tabla 4

Concentraciones de Cd (mg/kg) y porcentajes de reducción durante los meses de evaluación

Concentra-ciónes de Cd (mg/kg)	Grupos experimen-tales	Meses de evaluación
Concentra-ciónes de Cd (mg/kg)	Grupos experimen-tales	Mes 1	Mes 2	Mes 3
C1	G1	0,93	0,86	0,86
	G2	0,94	0,91	0,87
	G3	0,88	0,93	0,87
C2	G1	1,35	1,33	1,31
	G2	1,35	1,25	1,33
	G3	1,22	1,33	1,22
C3	G1	2,76	2,94	2,65
	G2	2,72	2,67	2,41
	G3	2,42	2,55	2,47

De los resultados expuestos en la Tabla 4, se observa el porcentaje de disminución de cadmio luego de finalizar el proceso de fitorremediación de los tres grupos experimentales (G1: Ricinus, G2: Ricinus + consorcio bacteriano y G3: consorcio bacteriano) en los principales tratamientos durante los meses de evaluación. Aquí se observa la evolución de absorción entre el mes 1 y el mes 3 respectivamente. Basándonos en los resultados de eliminación de cadmio en suelos, se puede concluir que las mejores tasas de eliminación fueron en el grupo G2 (Ricinus + consorcio bacteriano) en las 3 concentraciones (7,5% G2C1, 1,5% G2C2 y 11,4% G2C3), obteniendo un promedio de 7% de eliminación después de 3 meses de tratamiento.

En el análisis general de los datos, se denota el siguiente orden de efectividad de los tratamientos: G2, G1 y G3, entendiéndose que los elementos empleados para la remoción cumplen un mejor papel cuando se encuentran juntos.

Análisis de varianza (ANOVA) 3 factores sin replicación

El factor A representa los meses de evaluación (M1, M2 y M3), el factor B representa los grupos experimentales (G1, G2 y G3) y el factor C representa las concentraciones de Cd (C1 y C2), cabe resaltar que para este análisis no se consideró la concentración 3 por ser un valor inferior a los resultados reportados (Tabla 5).

Tabla 5

Resumen del modelo

R-cuadrado

(ajustado)

R-cuadrado
(pred)

2,19036

96,11%

83,47%

21,22%

Fuente: Software estadístico Minitab.

En la Figura 3 se obtienen los resultados para un nivel de confianza del 95%, en el cual se concluye que los efectos del modelo planteado no son significativos en las interacciones entre los factores. Realizando los contrastes al nivel de significancia de 0,05, tanto con el valor p como la comparación con el valor correspondiente a la f teórica y validado por el reporte del software Minitab, se concluye que es significativo sólo el efecto del factor C. Por tanto, a continuación, se mostrarán las gráficas individuales, así como las interacciones que comprenden este factor.

Figura 3. Diagrama de Pareto de efectos estandarizados para los factores evaluados

Se visualiza que el punto de intercepción que presenta el mayor valor corresponde al 3er mes en la concentración 2 de Cd (Figura 4). Asimismo, se demuestra una tendencia a incrementar el nivel de absorción conforme los meses de evaluación incrementan. Bauddh et al. (2016) evaluaron el crecimiento y biomasa de R. communis, así como la acumulación, translocación y división de Cd en diferentes partes de la planta. El periodo evaluado fue de 8 meses en suelo contaminado con Cd (17,50 mg Cd kg^-1 suelo). El resultado fue que las plantas estabilizaron el 51% de Cd, acumulándolo princi-palmente en sus raíces y el resto se translocó al tallo y las hojas. Es un valor superior que corres-ponde al tiempo evaluado en su estudio, por lo que a mayor edad de la planta (mayor crecimiento de vellosidades radiculares) y, por tanto, el resultado de absorción también aumenta.

Boda et al. (2017) propuso el uso del Ricino como cultivo de fitorremediación multipropósito para la fitoestabilización y revegetación de suelos conta-minados con residuos periurbanos, puesto que presenta resistencia a la toxicidad por metales pesados. Con este estudio, se refuerza la premisa de que el R. communis L. puede emplearse para la recuperación de suelos contaminados con metales pesados, especialmente para aquellos contaminados con Cd.

Figura 4. Gráfica de la interacción entre los meses de evaluación y las concentraciones de Cd.

Dentro de las publicaciones que apoyan la eficiencia de un consorcio bacteriano como el propuesto en esta investigación, se encuentran estudios como el de Tovar et al. (2021) donde se evaluó la capacidad de resistencia al cadmio de cinco cepas bacterianas, exponiéndolas a un rango de 2 mg/ml a 10 mg/ml de cadmio. Lo cual apoya al resultado de tolerancia evaluado en la primera etapa del presente estudio, en el que se trabajaron 3 grupos de aislamiento bacteriano: 1,4 ppm, 350 ppm y 500 ppm de cadmio.

Contrastando los resultados del presente experimento, se confirmó que el mejor grupo experimental era el conformado por el Ricinus más el consorcio bacteriano, lo que significa que ambos elementos desarrollan mejor sus funciones de absorción del metal en conjunto que por separado.

También se demuestra la potencialidad que tienen las bacterias utilizadas de los géneros: Klebsiella, Enterobacter y Bacterium. Que resurgen como una alternativa de solución frente a la problemática de acumulación de cadmio en suelos de importancia agrícola.

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Mues-tra	Localidad/distrito provincia/depar-tamento	Concentra-ción de Cd en suelo (mg/kg)	Concentra-ción de Cd en fruto de cacao (mg/kg)
S1	Huabal/Río Santiago/Condorcanqui/Amazonas	0,6079	1,15
S2	Huabal/Río Santiago/Condorcanqui/Amazonas	0,6532	2,10
S3	Yutupis/Río Santiago/Condorcanqui/Amazonas	0,3366	0,97