Efecto toxicológico del fluconazol y del traconazol en una prueba de Allium cepa

Toxicological effect of fluconazole and traconazole in an Allium cepa test

Luis Felipe Gonzales-Llontop^{1 *}; Mariel del Rocío Chotón-Calvo¹; Julio Chico-Ruíz²;

Miguel García-Torres¹; Álvaro Castañeda Mesía¹

1 Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas (UNTRM), Chachapoyas, Perú.

2 Laboratorio de Cultivos Celulares. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.

* Autor corresponsal: luis.gonzales@untrm.edu.pe (L. F. Gonzales-LLontop).

ORCID de los autores

L. F. Gonzales-Llontop: https://orcid.org/0000-0001-7944-2642          M. del R. Chotón-Calvo: https://orcid.org/0000-0001-6870-9268

J. Chico-Ruíz: http://orcid.org/0000-0002-7287-321X                           M. García-Torres: http://orcid.org/0000-0002-5487-3689

RESUMEN

Los antimicóticos son consumidos, frecuentemente, sin receta médica y en exceso ocasionando casos de toxicidad, manifestado como cefaleas, vómitos, dermatitis o hepatotoxicidad, etc. Con lo expuesto se realizó la experiencia de evaluar el efecto toxicológico del fluconazol y del traconazol en raicillas de Allium cepa. Se establecieron cuatro tratamientos: testigo (100 ml de agua destilada), problema 1 (fluconazol 0,8%), problema 2 (traconazol 0,8%) y problema 3 (fluconazol 0,8% más traconazol 0,8%). Se usó 20 bulbos de cebolla de las cuales se obtuvieron raicillas de 3,0 cm y estas fueron expuestas a los diferentes tratamientos. Posteriormente se hizo un “squash” con las raicillas y se hizo la tinción de Tjio y Levan (1956). El grupo que recibió fluconazol 0,8% presentó aberraciones cromosómicas clastogénicas como: puentes simples (2,3%) y puentes múltiples (3,3%) y aneugénicas: cromosoma pegajoso (1,8%) y cromosoma en espiral (1,9%) y sin aberraciones (90,7%) mientras el grupo con fluconazol 0,8% más traconazol 0,8% exhibió aberraciones cromosómicas tipo puente simple (2,6%), cromosoma en espiral (2,4%) y sin aberraciones (94,8%).  Se concluye que fluconazol 0,8% y traconazol 0,8% mostraron un efecto toxicológico en ápices de raíces de Allium cepa.

Palabras clave: Toxicológico; fluconazol; traconazol; aberración cromosómica.

ABSTRACT

Antifungals are frequently consumed without prescription and in excess, causing cases of toxicity, manifested as headaches, vomiting, dermatitis or hepatotoxicity, etc. Based on the above, an experiment was carried out to evaluate the toxicological effect of fluconazole and traconazole on Allium cepa roots. Four treatments were established: control (100 ml of distilled water), problem 1 (fluconazole 0.8%), problem 2 (traconazole 0.8%) and problem 3 (fluconazole 0.8% plus traconazole 0.8%). 20 onion bulbs were used from which 3.0 cm roots were obtained and these were exposed to different treatments. Later, a “squash” was made with the roots and the Tjio and Levan stain was performed (1956). The group receiving fluconazole 0.8% presented clastogenic chromosomal aberrations such as: single bridges (2.3%) and multiple bridges (3.3%) and aneugenic: sticky chromosome (1.8%) and spiral chromosome (1.9%) and without aberrations (90.7%) while the group with fluconazole 0.8% plus traconazole 0.8% exhibited chromosomal aberrations such as single bridge (2.6%), spiral chromosome (2.4%) and without aberrations (94.8%). It is concluded that fluconazole 0.8% and traconazole 0.8% showed a toxicological effect on root tips of Allium cepa.

Keywords: Toxicological; fluconazole; traconazole; chromosomal aberration.

Recibido: 28-10-2024.

Aceptado: 02-03-2025.

INTRODUCCIÓN

Los medicamentos antiinflamatorios, considerados como no esteroides (AINES) son los más empleados por la población en el tratamiento de sus enfermedades. Pero sus características químicas respecto a su toxicidad no son bien conocidas por lo que en varios países se ha suspendido su uso sin prescripción médica (Cano et al., 2017; Santos et al., 2019; Quintero, 2022).

El tratamiento, durante un largo tiempo, con antifúngicos no da una respuesta óptima a la mayoría de los pacientes. Varios estudios evalúan la eficacia del tratamiento (especialmente con itraconazol), cercano al 65% y a esto se suma las recurrencias, que se da en el 10-15% de los pacientes bajo tratamiento con este agente (Hun et al., 2013). Una de las posibles causas de esta baja eficacia, así como de las recurrencias en el tratamiento, podría ser un deficiente nivel plasmático, una disminución de la sensibilidad del patógeno al agente antifúngico, lo cual podría explicar la aparición de recurrencias en los pacientes adherentes al tratamiento (Romero et al., 2019). Además, los niveles mayores a los recomendados posiblemente generen efectos adversos y toxicidad que pueden terminar con el abandono del tratamiento por parte del paciente o la discontinuación por parte del médico tratante (Ashbee et al., 2014). El monitoreo terapéutico de drogas es importante, para asegurar una expo-sición adecuada a los medicamentos, con el fin de aumentar la eficacia, minimizar la resistencia y reducir los efectos secundarios.

Fluconazol, es un compuesto triazólico, y utilizado en el tratamiento de infecciones fúngicas sisté-micas específicas. Actúa inhibiendo la enzima lanosterol 14-α demetilasa en el complejo cito-cromo P-450 de los hongos, así inhibe la conversión de lanosterol a ergosterol, lo cual permite una pérdida de la integridad de la membrana fúngica (Ghannoum & Kuhn, 2002). Este compuesto tiene una alta biodisponibilidad luego de su administra-ción oral, alcanzado concentraciones plasmáticas ≥ 80% de las obtenidas en comparación a una dosis endovenosa y es el único preparado triazólico que se excreta mayoritariamente por el riñón (Muhl et al., 2000).

El traconazol es un antimicótico triazólico sintético que interfiere en la actividad del citocromo P-450, el cual es necesario para la desmetilación de los 14-alfa-metilesteroles a ergosterol. Por este meca-nismo, el ergosterol, sufre depleción, acción que daña a la membrana celular, y se trastornan sus funciones y permeabilidad. En dosis terapéuticas tiene actividad antiandrógena. Se absorbe rápido a través de la mucosa gastrointestinal cuando se administra con los alimentos, y al igual que su metabolito activo, se une extensamente a las proteínas plasmáticas (90%). Se metaboliza en el hígado, donde se forman diversos productos, incluyendo el hidroxiitraconazol, que también tiene actividad antimicótica. Sus metabolitos se eliminan en la orina y en las heces.

La presenciade diversos productos farmacológicos asociados con metales y el prolongado tratamiento de diferentes patologías debe preocuparnos  en sus efectos secundarios, especialmente  en el ADN de las diversas células que conforman el cuerpo humano (Banti & Hadiikakou, 2019),  detectándose daños cromosómicos irreversibles  de diversas formas lo que implica que el conjunto de genes humanos sigue siendo vulnerados lo que nos conducirá posiblemente a nuevas enfermedades crónicas y cancerígenas (Parvan et al; 2020; Quintero, 2022). coadyuvando a la gravedad de otras patologías humanas (Valentim et al., 2019; Ibañez & Angulo 2022).

Existe una gran variedad de bioensayos toxico-lógicos para sustancias farmacéuticas, dentro de los cuales el ensayo de toxicidad aguda con bulbos de Allium cepa “cebolla” (aceptado como biomo-nitor ecotoxicológico) se caracteriza por su bajo costo y fácil manipulación (Ortiz de García et al., 2017; Bhat et al., 2018).

Ante el desconocimiento sobre la toxicidad de estos fármacos se planteó el objetivo de calcular el efecto toxicológico del fluconazol y el traconazol en un test de Allium cepa. 

METODOLOGÍA

Se manejó 20 bulbos de cebolla que fueron sumer-gidas en agua en recipientes plásticos de volumen 200 ml. en un cuarto oscuro y a una temperatura de 20 ± 22 °C. Luego 3 días se seccionaron los ápices con una longitud de 3, cm con la finalidad de garantizar un ciclo celular notable.

Se ensayó como “tiempo cero” la exhibición de las raicillas de A. cepa en cafeína 0,1% La cafeína anhidra fue adquirida en el Laboratorio Insumos químicos, Lima, Perú. Los grupos de raicillas fueron inmersos en una solución de cafeína 0,1% usado como registrador de células y el “tiempo cero” por 3600 segundos (1 hora), con el propósito de lograr una agrupación de células binucleadas.

Se aplicó un esquema clásico (Figura 1), para las 4 agrupaciones: 1 agrupación testigo (T) y 3 agrupa-ciones problema (A, B y C) (Beltrán, 2015; Hernández et al., 2018). Se aceptó que las alteraciones cromosómicas fueron inducidas en el tiempo final de la replicación del ADN (Alberts et al., 2022). El traconazol (100 mg/capsula) fue fabricado por el laboratorio Salud Care PVT.LTD. Plot N° 435, India. El fluconazol (150 mg/capsula) fue elaborado por laboratorios Farmindustria (Línea Genérica), Lima, Perú. En las agrupaciones problema 1 y problema 2, los ápices de cebolla se pusieron por 4 horas con fluconazol 0,8% y traconazol 0,8% (considerando el estadio prematuro y final del ciclo duplicativo “S”). Desde la novena hasta la 11 ava hora estuvieron en agua pura para su restauración. En problema 3, se enfrentó desde la 4ta hora hasta la 8ava hora, una combinación de fluconazol 0,8% y el traconazol 0,8%. Finiquitada la 11ava hora a la 13ava hora, todos los grupos se pusieron en agua pura. Terminado el ensayo con los antimicóticos, los ápices fueron cortados, se aplicó el método de tinción rápida (Tjio & Leván, 1956) (orceína acética clorhídrica 1%). La orceína acética clorhídrica es un producto importado de la India y fue adquirida en el laboratorio Bio Genics Lab, Lima, Perú. La visualización en microscopio a mayor aumento (100X) y tomas fotográficas de las etapas analizadas. Las variables respuesta que se estimaron fueron la actividad toxicológica de fluconazol 0,8% y el traconazol 0,8%. y el deterioro citotóxico y genotóxico inducido por los antimicó-ticos mencionados. Se ensayaron cinco bulbos de cebolla para cada uno de los procesos.

Se observaron dos mil áreas microscópicas y se hizo el contraste entre los lotes de estudio por el test no paramétrico U de Mann–Withney, usando el modelo probabilístico y en SSPS v. 27,0. Ulterior-mente se estimó las medidas de media, varianza, desviación estándar; con anticipación a la variación arc sen de las proporciones genuinas.

Figura 1. Diseño Experimental usado para la inducción toxicológica en A. cepa L. T= Testigo; A, B y C = Sistemas experimentales; = Tratamiento con cafeína 0.1%;  = sistema A: fluconazol 0,8%; sistema B: traconazol 0,8%, sistema C: fluconazol 0,8% más traconazol 0,8%; * = fijación o sujeción de raicillas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Tabla 1 se presentan los promedios (%) del parámetro mitótico (PM) y de los parámetros de fase (PP = parámetro profásico; PMe = parámetro metafásico; PA = parámetro anafásico; PT = parámetro telofásico) de la agrupación tisular de Allium cepa en los cuatro tratamientos probados. Las tabulaciones de la agrupación testigo indican a los parámetros del grupo embrionario de A. cepa utilizados como comparación para ejecutar el enfrentamiento con los procesos sucesivos. El conjunto testigo presenta un parámetro mitótico (PM) de 10,4% ± 0,31 y un parámetro interfásico de 89,6%. Luego el lote tisular mitótico exhibe un parámetro profásico (PP) de 77,9%; parámetro metafásico (PMe) de 8,3%; parámetro anafásico (PA) de 6,6 y el parámetro telofásico (PT) de 7,2%. Los parámetros generales del ciclo celular observadas en el lote testigo son similares a los determinados por Beltrán & Beltrán (2016) y Gonzales et al. (2024).

En la Tabla 2 se observó un detenimiento de la longitud de las raicillas de A. cepa; entendiéndose que los antifúngicos ensayado serían los culpables de que las células ingresaron a un periodo de letargo tisular al interaccionar con un ambiente completamente desfavorable impidiendo el pro-greso de un ciclo reproductivo normal (Sabeen et al., 2020; Mota et al., 2022; Boumaza et al., 2024).

En el grupo testigo se observó un ciclo celular normal con todas sus fases progresivas (Figura 2); probándose una interfase normal donde el ciclo reproductivo (CR) de A. cepa se desarrolló normal-mente. En las agrupaciones problema 2 y problema 3, quienes estuvieron involucrados a la acción de los fármacos se notó que dichos grupos señalaron unos parámetros mitóticos de (PM) de 6,9% y 7,9% incluyéndose el producto del grupo 3 (8,1%) que en contraste con el grupo testigo que exhibió un porcentaje de 10,8%; demostrándose que las sustancias ensayadas disminuyeron considerable-mente la población celular de A. cepa comprobán-dose la alta citotoxicidad de las sustancias (Lagos et al., 2018; Mota et al., 2022; Arias et al., 2022).

En la tabla 3 se señala que se logró inducir con el fluconazol 0,8% (FLZ) con un 2,3% (Figura 2), la formación de puentes cromosómicos múltiples, lo que originó un mecanismo llamado translocación cromosómica, infiriéndose el elevado nivel de daño cromosómico con el que las células partieron a la siguiente división celular (Karp, 2019; Alberts et al., 2022; Ustundag et al., 2023). De la misma manera se asigna en la Tabla 4 se aprecia la generación de un cromosoma aislado (Figura 3) el cual se produjo por la alteración de la doble molécula de ADN (Kesti et al., 2024).

Tabla 1

Valores de citotoxicidad del fluconazol y del traconazol verificados con la media de los Parámetros interfásico (P.I.) y mitótico (P.M.) y Parámetros de fases de Allium cepa

GRUPO	P.I.	P.M.	P.P.	P. Me	P.A.	P.T.
TESTIGO	89,2	10,8±0,32^a	78,5	8.2	6.7	6.6
FLUCONAZOL (P1)	96,1	6,9±0,21^b	81,3	7.4	6.2	5.1
TRACONAZOL (P2)	92,1	7,9±0,22^a	79,9	7.1	6.4	6.6
FLUCZ + TRACONZ (P3)	91,9	8,1±0,14	81,1	8,2	6,1	4,6

a, b: p < 0,05 respecto al testigo. PI: parámetro interfásico. PM: parámetro mitótico. PP: parámetro profásico, PMe= parámetro metafásico. PA: parámetro anafásico. PT: parámetro telofásico. Los parámetros se expresaron en porcentajes (%). Se examinaron 2000 células de A. cepa por proceso.

Tabla 2

Disparidad de promedios de largura de radículas de Allium cepa antes y después de los procesos

GRUPOS	T1		T2		T3		T4		T5
	PRE	POST	PRE	POST	PRE	POST	PRE	POST	PRE	POST
TESTIGO (T)	3,0	3,4	2,9	3,4	3,2	3,7	2,8	3,3	2,7	3,2
FLUCONAZOL (P1)	3,2	3,3	3,5	3,7	3,4	3,6	3,4	3,5	3,8	3,9
TRACONAZOL (P2)	2,5	2,6	2,3	2,5	2,2	2,2	2,4	2,5	3,0	3,1
FLZ + TRACZ (P3)	2,7	2,8	3,0	3,1	2,9	3,0	2,6	2,8	2,9	3,0

Leyenda: T (grupo testigo), P1 (grupo problema 1), P2 (grupo problema 2) y P3 (grupo problema 3); FLZ (fluconazol), TRACZ (traconazol).

Figura 2. Célula de radícula de Allium cepa presentando múltiples puentes cromosómicos inducidos por fluconazol 0,8% (1000X).

Figura 3. Aberración clastogénica tipo cromosoma aislado inducido por traconazol 0,8 % (1000X).  

La otra posibilidad de la configuración de estas dos anormalidades cromosómicas (Makar & Makar, 2024) se debería al fracaso de los sistemas de reparación nuclear ante la fuerte agresión de las sustancias genotóxicas puestas en acción y no cabe duda de que este daño podría solaparse y las células continuarían reproduciéndose y en cualquier momento se desatarían una cascada de ciclo celulares anormales e incontrolables (Morales & García, 2019). La presencia de estas dos aberraciones clastogénicas podrían haber causado estrés oxidativo permitiendo un grave deterioro genético (Mesnage et al., 2021).

En la Figura 4 la ordenación de los cromosomas en la metafase, pareciera que el efecto del fluconazol 0,8% interrumpió la unión de las fibras del huso a las zonas centroméricas permitiendo el caos espacial de los cromosomas seccionándolos y promoviendo la adhesión o conexión de los cromosomas afectados y por ende la construcción de un cromosoma adhesivo o pegajoso (Chowdhary et al., 2022; Animasaun et al., 2024). Aunque los cromosomas en metafase han llegado al máximo punto de su condensación, pareciera que las fuerzas equilibrantes de las fibras del huso y las dos placas cinetocóricas opuestas que están mirando hacia los polos están completamente perturbadas (Wijeyaratne & Wickramasinghe, 2020). 

Figura 4. Aberración aneugénica tipo cromosoma pegajoso inducido por fluconazol 0,8% y traconazol 0,8% (1000X).

Tabla 3  

Promedio de trastornos cromosómicos producidos por el fluconazol 0,8% en radículas de Allium cepa

	Anomalías cromosómicas
	Clastogénicas			Aneugénicas
	PCm	PCs	CA	CP	CE	SA
CÉLULAS EN ANAFASE	*2,3	*3,3	-	*1,8	1,9	90,7
VARIANZA	0,05	0,17	-	0,03	0,07	0,5
ERROR STANDARD	0,02	0,06	-	0,5	0,3	0,2

Leyenda: PCs: puente cromosómico simple, PCm: puente cromosómico múltiple, CA: cromosoma aislado, CP: cromosoma pegajoso, CE: cromosoma en espiral; SA: sin aberraciones. Se tabularon 2000 células de A. cepa por procedimiento.

Tabla 4  

Promedio de trastornos cromosómicos producidos por traconazol 0,8% en radículas de Allium cepa

	Anomalías cromosómicas
	Clastogénicas			Aneugénicas
	PCm	PCs	CA	CP	CE	SA
CÉLULAS EN ANAFASE	-	*2,2	3,5	-	2,4	91,9
VARIANZA	-	0,06	0,18	-	0,07	0,3
ERROR STANDARD	-	0,02	0,07	-	0,03	0,1

Leyenda: PCs: puente cromosómico simple, PCm: puente cromosómico múltiple, CA: cromosoma aislado, CP: cromosoma pegajoso, CE: cromosoma en espiral; SA: sin aberraciones. Se estimaron 2000 células de A. cepa por procedimiento.

El estudio de la Figura 5 donde se estructuró el cromosoma en hélice o espiral, indicaría que la síntesis de los microtúbulos (ejecutada por enzimas que promueven la síntesis y el ensamblaje de tubulina) provenientes del huso mitótico quedó interrumpida por la actividad del fluconazol 0,8%, comprometiéndose también la condensación de los cromosomas (Altamirano, 2019; Parveen et al., 2023). El ciclo celular está controlado por un sistema molecular que vigila cada paso realizado. En regiones concretas del ciclo, la célula comprueba que se cumplan las condiciones moleculares y celulares y para pasar a la fase siguiente, si esto no se cumple el ciclo se detiene. Aquí destaca el avance de la metafase hacia al anafase en células meristemáticas vegetales, este evento está estimulado por las fitohormonas auxinas y citoquininas (López et al., 2019; Vera, 2020).

Figura 5. Aberración aneugénica tipo cromosoma en espiral inducido por fluconazol 0,8% (1000X).

La Figura 6 presenta una célula radicular con numerosos nucleolos dismórficos inducido por la actividad citotóxica del fluconazol 0,8% y esto puede ser una de las causas de las diversas formas de cáncer. Las alteraciones morfológicas y funcionales del nucleolo examinadas en las células de una estirpe tumoral son producto de una elevada demanda de ribosomas y de permutaciones en los procesos de monitoreo de la multiplicación celular que cualifican a estas células. El trastorno de la función de dos proteínas, pRb y p53, que tienen un rol supresor tumoral, inducen en las células tumorales un desajuste en la producción de ribosomas. La correlación entre cáncer e hipertrofia nucleolar recomienda un rol notable de ésta última en la formación de tumores.

Figura 6. Célula de radícula de A. cepa presentando numerosos nucléolos dismórficos estimulados por actividad del fluconazol 0,8% (1000X).

El caos en la síntesis de ribosomas y las permutas moleculares de los mismos inciden al mismo tiempo en la alteración neoplásica de las células mediante el trastorno de las proteínas sintetizadas (Vega et al., 2021; Barrionuevo & Dueñas, 2019; Cipriano, 2023). Se debe recalcar el hallazgo de otras anomalías nucleares utilizando metalofármacos (Banti & Hadjikakou, 2019) donde se encontró formación de micronúcleos con la consecuente inducción de malformaciones cromosómicas.

Esta experiencia verifica el poder citotóxico y genotóxico del fluconazol 0,8% y traconazol 0,8%, semejante a lo investigado por Banti & Hadiikakou, (2019); y Zurita et al. (2017) lo cual debe interesar a la comunidad médica cuando se realiza tratamientos muy prolongados.

Se concluye que a una concentración de fluconazol 0,8% más traconazol 0,8% se presenta un efecto toxicológico en ápices de A.  cepa, recomendando revisar las concentraciones utilizadas y el tiempo de tratamiento en el caso de enfermedades fúngicas.

CONCLUSIONES

A una dosis de fluconazol 0,8% más traconazol 0,8% se comprobó un notable efecto toxicológico en ápices de Allium cepa.  En las agrupaciones problema 2 y problema 3, señalaron unos parámetros mitóticos de (PM) de 6,9% y 7,9% que en contraste con el grupo testigo exhibió un 10,8%; esto demuestra que los fármacos ensayados disminuyeron considerable-mente la población celular de A. cepa comprobándose la alta toxicidad de estas sustancias. La agrupación problema 2 que percibió fluconazol 0,8% presentó aberraciones clastogénicas como puentes simples (2,3%) y puentes múltiples (3,3%) y aneugénicas como cromosoma pegajoso (1,8%) y cromosoma en espiral (1,9%) y sin aberraciones (90,7%); mientras el grupo que aceptó fluconazol 0,8% más traconazol 0,8% exhibió aberraciones tipo puente simple (2,6%), cromosoma en espiral (2,4%) y sin aberraciones (94,8%). Las dosis empleadas de fluconazol 0,8% y traconazol 0,8% impidieron el desarrollo en longitud de las raicillas de Allium cepa.

Deberá ampliarse el presente estudio en un modelo de animales con dosis y tiempos de ensayo diferentes que demuestre el nivel toxicológico de los medica-mentos antifúngicos ensayados.

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