Identificación molecular de Meloidogyne spp. asociados al cultivo de banano (Musa spp.) en Tumbes, Perú

Molecular identification of Meloidogyne spp. associated with banana (Musa spp.) cultivation in Tumbes, Peru

Jesus Moreto-Aguirre¹; Alberto Ordinola-Zapata²; Tessy Peralta–Ortiz²; Gloria Ochoa Mogollón¹

Enedia Vieyra-Peña²; Pedro Masías²; Jalmer Campaña-Olaya¹; Héctor Sánchez-Suárez^{1 *}

1 Universidad Nacional de Tumbes. Facultad de Ciencias Agrarias. Corrales, Tumbes, Perú.

2 Universidad Nacional de Tumbes. Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar. Calle Los Ceibos S/N. Puerto. Pizarro, Tumbes, Perú.

* Autor corresponsal: hsanchezs@untumbes.edu.pe (H. Sánchez-Suárez).

ORCID de los autores:

J. Moreto-Aguirre: https://orcid.org/0000-0003-4698-0078 A. Ordinola-Zapata: https://orcid.org/0000-0002-9644-0531

T. Peralta-Ortiz: https://orcid.org/0000-0001-5907-7713 G. Ochoa Mogollón: https://orcid.org/0000-0003-4698-0078

E. Vieyra-Peña: https://orcid.org/0000-0001-6541-7075 P. Masías: https://orcid.org/0000-0001-5173-8409

J. Campaña-Olaya: https://orcid.org/0000-0002-0804-1208 H. Sánchez-Suárez: https://orcid.org/0000-0003-2395-5056

RESUMEN

La presencia de nematodos agalladores en las plantas aumenta su susceptibilidad a infecciones, ya que estos daños facilitan el ataque de otros agentes patógenos. El objetivo de este estudio fue determinar taxonómicamente la presencia del nematodo Meloidogyne y la especie predominante en los cultivos de banano en departamento de Tumbes. Se recorrieron las principales zonas bananeras, áreas paralelas al río, recolectando hembras grávidas extraídas de las raíces de banano para identificación molecular, se realizó el conteo de nematodos en el suelo y las raíces de algunas áreas, para la extracción de ADN se utilizó el kit Presto™ Soil DNA Extraction Kit (Geneaid) y la amplificación se realizó con primers específicos para el género Meloidogyne y cinco de sus especies: M. incognita, M. javanica, M. enterolobii, M. arenaria, y M. hapla. Las muestras recolectadas mostraron una alta prevalencia de Meloidogyne en todas las áreas. Ocho resultaron positivas para M. incognita y ninguna para otras especies, este estudio, es uno de los primeros informes de Meloidogyne asociado al banano (Musa spp.), en Tumbes, destaca la presencia M. incognita, conocida por su capacidad parasitaria y causar de daños económicos, permitiendo el diagnóstico prematuro para ejecutar planes de contingencia en zonas bananera.

Palabras clave: Nematodo agallador; Meloidogyne; Fitoparásito; identificación molecular; masa de huevos; hembras grávidas.

ABSTRACT

The presence of root-knot nematodes in plants increases their susceptibility to infections, since this damage facilitates the attack of other pathogens. The objective of this study was to taxonomically determine the presence of the nematode Meloidogyne and the predominant species in banana crops in the department of Tumbes. The main banana growing areas, areas parallel to the river, were visited, collecting pregnant females extracted from banana roots for molecular identification, the main banana growing areas, areas parallel to the river, were visited, collecting pregnant females extracted from banana roots for molecular identification. Nematodes were counted in the soil and roots of some areas. The Presto™ Soil DNA Extraction Kit (Geneaid) was used for DNA extraction and amplification was performed with specific primers for the genus Meloidogyne and five of its species: M. incognita, M. javanica, M. enterolobii, M. arenaria, and M. hapla. The samples collected showed a high prevalence of Meloidogyne in all areas. Eight were positive for M. incognita and none for other species. This study, one of the first reports of Meloidogyne associated with banana (Musa spp.) in Tumbes, highlights the presence of M. incognita, known for its parasitic capacity and cause of economic damage, allowing early diagnosis to execute contingency plans in banana areas.

Keywords: Root-knot nematode; Meloidogyne; Phytoparasite; molecular identification; egg mass; gravid females.

Recibido: 18-11-2024.

Aceptado: 02-03-2025.

El cultivo de banano (Musa spp.) representa una de las actividades agrícolas más importantes y de mayor impacto económico en diversas regiones tropicales del mundo y en el Perú (Sousa et al., 2024; Van den houwe et al., 2020), especialmente en los departamentos de la costa Norte, el banano constituye una fuente crucial de ingresos para numerosos agricultores y comunidades, 90 000 ha en Tumbes, dedicada esencialmente a la agricul-tura , donde más de 6000 agricultores se dedican al cultivo, predominantemente de arroz junto con banano, maíz y otras frutas (Marshall et al., 2018) . Sin embargo, el cultivo enfrenta diversos desafíos fitosanitarios que amenazan su productividad y sostenibilidad. Entre estos, los nematodos del género Meloidogyne (Sousa et al., 2024), conocidos comúnmente como nematodo agallador, se desta-can por su capacidad de causar severos daños a las raíces de las plantas, resultando en pérdidas significativas en el rendimiento y calidad de los frutos de este y otros cultivos en el Perú (Lima-Medina et al., 2024).

Meloidogyne spp. comprende una amplia diversidad de especies y biotipos que poseen distintas adaptaciones y mecanismos de parasitismo, lo que complica su manejo y control efectivo en los cultivos (Lopes et al., 2019), como el nematodo nodulador de las raíces o nematodo de las agallas, Meloidogyne spp., que afecta la rentabilidad de dichos cultivos (Ramos, 2023), representan el grupo de mayor importancia económica entre los nematodos fitoparásitos (Lima-Medina et al., 2018), prevalecen en regiones templadas y tropicales, predominando en los sistemas agrícolas de subsistencia (Seenivasan & Senthilnathan, 2018), son devastadores para la calidad y el rendimiento de los cultivos (Olajide et al., 2023). La caracterización molecular de estos nematodos es rápida y es fundamental para entender su distribución, diversidad genética y relación con el cultivo de banano (Van den houwe et al., 2020). A través de herramientas moleculares, es posible identificar con precisión las especies presentes, evaluar su variabilidad genética y desarrollar estrategias de manejo integradas y sostenibles. No se han identificado molecularmente estas especies en el departamento de Tumbes, pero si están reportadas las especies de dichos nematodos en otros cultivos de casi todos los departamentos del país (Flores-Choque et al., 2017).

La caracterización molecular de Meloidogyne spp. asociados al cultivo de banano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et al., 1986), permite analizar su diversidad genética, siendo una herramienta imprescindible para: el manejo fitosanitario de éstos patógenos (Vera Obando, 2014), la comprensión de su impacto en la salud del cultivo, la identificación de especies de patógenos específicas y su distribución. Es además una herramienta útil en el diseño de programas para la implementación de estrategias de manejo efectivas (Coyne et al., 2007), permitiendo un uso racional del manejo agronómico y la utilización adecuada de sustancias controladoras evitando la contaminación ambiental y la eliminación de fauna y flora benéfica del suelo (Calle et al., 2017), contri-buyendo de esa manera a la sostenibilidad y productividad del cultivo de banano.

El objetivo fue aplicar conocimientos y técnicas de biología molecular para caracterizar rápida de las especies de nematodos Meloidogyne asociadas al cultivo de banano, con el fin de generar contribuir al diagnóstico y manejo de estos fitopatógenos.

Zonas de muestreo

El estudio se llevó a cabo en campos agrícolas dedicados al cultivo de banano (Musa spp.), distribuidos en la costa del departamento de Tumbes, norte de Perú, los cuales cubren 2500 ha. Las muestras se recolectaron de la mayoría de localidades productoras de banano en Tumbes. Se recolectaron en total 76 muestras que abarcaron la margen izquierda (de Rica Playa a Cerro Blanco) y derecha (de Becerra a Cruz Blanca) del río Tumbes, así como la margen izquierda del río Zarumilla (de Tutumo a Uña de Gato). Las ubicaciones precisas de los puntos de muestreo se observan más adelante en la Figura 1 y Tabla 2. Las zonas donde se recogieron las muestras están influenciadas por diversos ecosistemas y factores climáticos (Marengo et al., 2014), como el bosque seco (Barboza et al., 2022), el bosque semi húmedo en su parte alta (Zarumilla) (Contrera López et al., 2012) y en la parte media y baja de ambos márgenes del río Tumbes. También es afectado periódicamente por ENSO (El Niño–Oscilación del Sur) niño global y niño costero (Pécastaing et al., 2024), afectando todos los ecosistemas y cultivos (Marengo et al., 2014). Otro factor que afecta el cultivo de banano es la temporada de estiaje del río Tumbes ya que la mayoría de los cultivos se encuentran condicionados por el río, lo que cambia las condiciones del hábitat de los organismos asociados al banano.

Recolección de muestras de raíces de banano infestadas por nematodos

Se recolectaron 0,5 kg de raíces de banano (Musa spp.) que mostraron sintomatología compatible con infestación por nematodos. El muestreo fue manual y dirigido; se excavó un hoyo de 20 x 20 x 20 cm cerca de la base del pseudotallo del banano sin fruto, hasta encontrar raíces con síntomas sospechosos de nematodos (Calle et al., 2017). Las raíces fueron llevadas, manteniendo las condicio-nes adecuadas para su conservación, hasta el Laboratorio de Entomología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Tumbes (UNTUMBES), para realizar el aislamiento de los nematodos, basado en la morfología única de las hembras grávidas Meloidogyne spp. y el lugar donde parasita (Jaramillo-Pineda et al., 2015).

Identificación molecular de las especies de nematodos

Se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar de la UNTUMBES, siguiendo la metodología descrita por Carvalho et al. (2019) y Schloss et al. (2009), que de manera resumida se indica a continuación: Con una aguja de disección se aisló 5 nematodos hembras adultas las cuales fueron, lavadas y desinfectadas con agua destilada (5% de hipoclorito de sodio) y almacenadas en un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml (Karajeh et al., 2010) y suspendidas en etanol al 99% hasta su procesamiento. Las muestras de las hembras colectadas, se retiraron del etanol al 99% y se centrifugaron por 1 minuto a 10 000 rpm, luego se recuperó el sobrenadante, que fue macerado para poder realizar la extracción (Karajeh et al., 2010) de su ADN empleando Presto™ Soil DNA Extraction Kit (Geneaid) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó una amplificación del ADN mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando los primers que se detallan en la Tabla 1. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 μl en un termociclador con un procesamiento térmico consistente en un ciclo inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de amplificación (desnaturalización: 94 °C por 1 minuto y 30 segundos, extensión: 68 °C por 2 minutos), y un ciclo final de extensión a 68 °C por 5 minutos. La confirmación de los productos de la PCR se hizo mediante electroforesis en gel de agarosa 1,5% (Skantar et al., 2008) a 90 voltios por 15 minutos. Las bandas resultantes se visualizaron bajo luz UV (Mutala’liah et al., 2019). Las ampliaciones se enviaron para su secuencia miento al extranjero mediante una empresa de la localidad, que dio tal servicio. Las secuencias nucleótidas recibidas, se analizaron para determinar su calidad con el software FastQC 0.11.9, luego se recortaron las porciones de los extremos 5’ y 3’ de las secuencias, en las que hubo calidad demasiado baja, usando el software Chromas 2.6.6. Las secuencias se alinearon y se obtuvieron secuencias consenso utilizando el software MEGA-7. Se realizó la búsqueda, utilizando las secuencias consenso, en la base de datos de GenBank, pertenenciente al Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), para lo cual se empleó la aplicación en línea Basic local aligment and search tool (BLAST) disponible en la dirección: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Los resultados de la búsqueda, establecieron la identificación de los ejemplares a nivel de especie. Finalmente se calcularon los porcentajes de diversidad y abundancia de las especies identificadas con los softwares Mothur y Excel (Schloss et al., 2009).

Especie	Código de primers		Secuencia de los primers 5’ A 3’	Tamaño del fragmento (pb)	Reference
Meloidogyne spp.	MF	GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG		500	(Blaxter et al., 1998)
	MR	AACCGCTTCGGACTTCCACCAG
Meloidogyne incognita	Mi-F	GTGAGGATTCAGCTCCCCAG		900	(Xu et al., 2004)
	Mi-R	ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC
Meloidogyne javanica	Fjav	GGTGCGCGATTGAACTGAGC		700	(Zijlstra et al., 2000)
	Rjav	CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC
Meloidogyne enterelobii	Me-F	AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG		256	(Dong et al., 2001)
	Me-R	TCAGTTCAGGCAGGATCAACC
Meloidogyne hapla	Me-F	TGACGGCGGTGAGTGCGA		610	(Zijlstra et al., 2000)
	Me-R	TGACGGCGGTACCTCATAG
Meloidogyne arenaria	Ma-F	TCGAGGGCATCTAATAAAGG		950	(Dong et al., 2001)
	Ma-R	GGGCTGAATATTCAAAGGAA

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Punto	Localidad	Muestra genómica	Latitud	Longitud
1 3 4 5 6 7 8 9 11 15 16 18 19 21 22 23 27 30 31 31 33 34 35 36 37 40 41 42 42 43 44 45	PT_Rica_Playa_1 PT_Rica_Plata_3 PT_Higueton4 PT_Carretas_5 PT_Casa_Blanqueada_6 PT__Oidor_7 PT_Vaqueria_8 PT__Franco_9 PT_La_Peña_11 PT_15_Cerro_Blanco PT_p16_Cerro_blanco PT_18_El_Tutumo PT_19_Tutumo PT_21_la_totora PT_22_mata_palo PT_26 Pueblo nuevo PT_27_La_coja PT_30_el_limon PT_31_cabuyal PT_31_cabuyal PT_33_Becerra PT_34_Pampas_de_Hospital PT_35_santa_Maria_PH PT_36_Cruz_blanca PT_37_las_brujas PT_40_Estreros PT_41_la_jota PT_42_Los_Cedros PT_42_Los_Cedros PT_43_San_Jose PT_44_Rio_Viejo PT_45_corrales	5 4 11 3 13 9 14 7 1 16 18 21 20 23 24 27 26 31 33 34 36 38 40 42 44 46 47 49 50 55 54 51	-3.813128322 -3.80289353 -3.764981528 -3.740060688 -3.740060688 -3.725413104 -3.700352961 -3.685637133 -3.669894878 -3.653092015 -3.652208684 -3.690952297 -3.6912682 -3.690021828 -3.685224592 -3.616495959 -3.595733267 -3.725066157 -3.721123936 -3.723055068 -3.723709818 -3.686924606 -3.67845997 -3.671941219 -3.648147023 -3.571984584 -3.615694572 -3.614310294 -3.614310294 -3.561448528 -3.583946004 -3.600672856	-80.49788799 -80.51038105 -80.45872137 -80.45370899 -80.45370899 -80.45374788 -80.44964645 -80.45580111 -80.44825237 -80.4017318 -80.382035 -80.28446764 -80.27107478 -80.22041783 -80.20380154 -80.20316854 -80.20791572 -80.4363903 -80.43952011 -80.45323826 -80.41975893 -80.43821186 -80.43814816 -80.43048039 -80.42785451 -80.51243998 -80.54914098 -80.53234767 -80.53234767 -80.46435468 -80.46918064 -80.45920786

Identificación de nematodos del género Meloidogyne

En los muestreos realizados inicialmente, se observó que en la mayoría de puntos de muestreo se hallaron nematodos Meloidogyne spp., como se evidencia en la Figura 2; de igual manera, en los muestreos finales también se observó con mucha frecuencia ese género; como se observa en las figuras 2 y 3, en las que se aprecia la presencia de bandas luminosas producidas por amplicones con un tamaño de alrededor de 500 pb compatibles con el tamaño de fragmento esperado para la amplificación usando los primers MF y MR, que son específicos para el género Meloidogyne (Tabla 1). El hallazgo de nematodos Meloidogyne spp. en las zonas estudiadas fue de esperar, puesto que, en cultivos de banano realizados en zonas geográficas cercanas al departamento de Tumbes, también se han detectado; como en el caso del departamento de Piura (Holguin, 2018) y en la provincia de El Oro (Ecuador) (Calle et al., 2017).

La presencia de Meloidogyne en cultivos de banano que se reporta en esta investigación está en coherencia con estudios realizados en otras localidades, en las que también se ha hallado este género de nematodos habitando alrededor de las raíces de plantas de banano en regiones tropicales y subtropicales, estando particularmente presentes en suelos bien drenados, arenoso y áreas agrícolas irrigadas (Lima-Medina et al., 2024; Nithya Devi et al., 2023; Silva et al., 2024); condiciones que se presentan en el departamento de Tumbes y que son propicias para que esté presente este nematodo en todas las zonas de muestreo.

Identificación de nematodos de ciertas especies de Meloidogyne

De las cinco especies de Meloidogyne: M. incognita, M. javanica, M. enterelobii, M. hapla y M. arenaria, que se intentaron detectar; solo la primera fue identificada en ocho de las muestras (20, 21, 24, 40, 42, 44, 46 y 54), como se observa en la figura 4, en la que se aprecia bandas luminosas correspon-dientes a amplicones de alrededor de 900 pb compatibles con el tamaño de fragmento esperado para Meloidogyne incognita (Tabla 1) identificado en la base de dato de National Center for Biotechnology Information (NCBI) con ID: gi|1808524156|MN728679.1. y ID: gi|815932471|KP253749.1, Cobertura (99%) Identidad (97% a 98,11%).

La presencia de Meloidogyne incognita en cultivos de banano, corresponde al primer reporte de tal especie en el departamento de Tumbes, puesto que luego de hacer la revisión de la literatura científica, no se ha encontrado ningún documento que acredite la presencia de tal especie. M. incognita es una de las cuatro especies más importantes de nematodos agalladores, debido a su amplia distribución a nivel mundial y por afectar a muchos tipos de cultivos, esta especie ha sido una de las primeras identificadas en Ecuador en 1974 (Calle et al., 2017). Dada la cercanía geográfica de Ecuador al departamento de Tumbes, era de esperar que en la zona también pudiera existir tal especie de nematodo, aunque hasta la fecha no había sido reportada.

Por otra parte, en el caso de las especies M. hapla, M. enerelobii, M. arenaria y M. javanica no se pudo identificar ejemplares de las mismas, pero dado que en la mayoría de muestras se detectó nematodos del género Meloidogyne, lo que podría sugerir la presencia de especies diferentes a las cinco que se intentaron determinar en esta investigación (Mullis et al., 1986; Romero et al., 2019; Skantar et al., 2008).

Distribución de nematodos Meloidogyne y efecto en las raíces del banano

Meloidogyne estuvo presente en todos los cultivos de banano muestreado en las diferentes zonas de Tumbes, solo M. incognita, se identificó en tres zonas de Tumbes: Zona alta (entre el Tutumo y Matapalo), zona media (entre Pampas de Hospital, Cruz Blanca, Las Brujas (zona media, margen derecho del río Tumbes) y zona baja de Tumbes sector Río Viejo y Pampa de la Gallina.

La identificación rápida y precisa de estos microorganismos es esencial para el manejo y mejoramiento óptimo de los cultivos (Artavia-Carmona & Peraza-Padilla, 2020). Esto solo es posible mediante estudios regulares y exhaustivos de la detección de las poblaciones de especies de Meloidogyne en las áreas agrícolas de cada región.

El estudio mostró un ligero daño a las raíces del banano por parte del nematodo agallador en cultivos de dicha planta en la margen izquierda del río Tumbes. En zonas más alejadas, como Rica Playa y Tutumo, se encontraron menores cantidades de nematodos. Posiblemente hay una relación entre el suelo arenoso y la presencia de nematodos agalladores, así como la presencia de hembras en raíces, pues se ha observado un menor daño con una mayor cantidad de hembras grávidas (Jaramillo-Pineda et al., 2015).

Entre las especies encontradas, Meloidogyne incognita es la que ha reportado mayores daños y pérdidas económicas (Gorny et al., 2019; Nithya Devi et al., 2023), posiblemente debido a la presión y respuesta que han dado lugar a la aparición de biotipos virulentos de esta especie, capaces de reproducirse en los cultivos comerciales establecidos en campo (Lopes et al., 2019). Esta especie tiene una amplia distribución geográfica, adaptándose a diferentes ambientes (Seenivasan & Senthilnathan, 2018). Se estima que es un patógeno emergente que se ha distribuido rápidamente en todo el mundo, causando pérdidas en la producción de hortalizas, como el tomate, de hasta un 70% (Pérez et al., 2017).

La presencia de Meloidogyne en Tumbes puede estar relacionada con las características del tipo de suelo y las condiciones climáticas de cada área muestreada (Guzmán-Piedrahita et al., 2023). La mayoría de los cultivos de banano se encuentran en zonas cercanas al río, donde los sistemas agrícolas mantienen una humedad constante, facilitando el movimiento rápido de los nematodos hacia sus plantas hospederas, esto les permite penetrar y reproducirse rápidamente dentro de las raíces, lo que conduce al incremento de sus poblaciones en el campo (Sousa et al., 2024).

Punto	Área (ha)	Escala Nódulos	*Cantidad de nematodos Meloidogyne* spp**
Punto	Área (ha)	Escala Nódulos	100 g de raíz	100 g de suelo
PT_30_el_limon	1,0	2	100	733
PT_33_Becerra	0,5	2	100	533
PT_31_cabuyal b	1,0	1	150	367
PT_31_cabuyal	1,0	3	500	3 367
PT_33_Becerra b	1,0	1	133	367
PT_34_Pampas_de_Hospital	1,0	1	100	133
PT_Vaqueria_8 a	1,0	2	200	3 167
PT_Vaqueria_8	1,0	3	433	8 300
PT__Oidor_7	1,0	1	433	900
PT_37_las_brujas	1,0	2	500	1 700
PT_36_Cruz_blanca	1,0	3	567	800
PT_35_santa_Maria_PH	1,0	3	700	1 333

Estado de daño de raíz de menor a mayor de 1 a 5. Índice de Nódulos Radicales (INR) (escala 1=0, 2=1 a 25, 3=26 a 50, 4=51 a 75 y 5=76 a 100% del sistema radical agallado estos (Salazar-Antón & Guzmán-Hernández, 2013).

Artavia-Carmona, R., & Peraza-Padilla, W. (2020). dentificación morfológica, morfométrica y molecular de Meloidogyne exigua (Göeldi 1887) en café (Coffea arabica). Agronomía Mesoamericana, 31(3), 531-545. https://doi.org/10.15517/AM.V31I3.38733

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