Bioformulado en polvo humectable con conidias de Trichoderma asperellum: Desarrollo y eficacia contra Rhizoctonia solani en plántulas de algodón

Wettable powder bioformulation with Trichoderma asperellum conidia: Development and efficacy against Rhizoctonia solani in cotton seedlings

Yuri H. Calle-Cheje^1*; Leonor Mattos Calderón²

1 Universidad Católica Sedes Sapientiae, Campus Santa María, Av. Real N° 809, Distrito de Santa María, Huaura. Lima, Perú.

2 Universidad Nacional Agraria La Molina, Av. La Molina s/n, distrito de La Molina. Lima, Perú.

* Autor corresponsal: yuricalle@hotmail.com (Y. H. Calle-Cheje).

ORCID de los autores:

Y. H. Calle-Cheje: https://orcid.org/0000-0001-5802-1101 L. Mattos Calderón: https://orcid.org/0000-0003-4773-8582

RESUMEN

El incremento en la demanda de productos biológicos para la agricultura contrasta con las limitaciones de las formulaciones convencionales de Trichoderma, caracterizadas por su corta vida útil, lo que dificulta su almacenamiento, transporte y comercialización. Frente a este vacío tecnológico, el objetivo del estudio fue obtener e identificar aislados de Trichoderma y desarrollar un bioformulado en polvo humectable a base de caolín y bentonita, evaluar su eficacia para el control de Rhizoctonia solani en plántulas de algodón bajo condiciones de maceta. Aislados obtenidos desde suelos de la costa central del Perú, se caracterizaron morfológica y molecularmente mediante regiones ITS, identificándose dos como Trichoderma asperellum (TCal y TCh2). El antagonismo in vitro frente a R. solani se evaluó mediante placas precolonizadas y filtrados. T. asperellum TCal se multiplicó en sustrato de maíz, alcanzando 1,47 × 10⁹ conidias g⁻¹. Formulados con 12 % de conidios mantuvieron más de 1,18 × 10⁹ conidias g⁻¹ tras 90 días de almacenamiento a 19 - 24 °C y 1, 21 x 10⁹ a 4 °C, todos con viabilidad superior al 95%. En invernadero, estas formulaciones redujeron significativamente la severidad de la enfermedad causada por R. solani, con eficacias de control entre 57,5% y 58,3%. Estas formulaciones facilitarán el transporte, almacenamiento y uso comercial de Trichoderma como agente de control biológico.

Palabras clave: control biológico; formulación; caolín; bentonita; vida útil.

ABSTRACT

The increasing demand for biological products in agriculture contrasts with the limitations of conventional Trichoderma formulations, characterized by their short shelf life, which hinders their storage, transport, and marketing. Faced with this technological gap, the objective of this study was to obtain and identify Trichoderma isolates and develop a wettable powder bioformulation based on kaolin and bentonite, evaluating its efficacy in controlling Rhizoctonia solani in cotton seedlings under pot conditions. Isolates obtained from soils on the central coast of Peru were morphologically and molecularly characterized using ITS regions, identifying two as Trichoderma asperellum (TCal and TCh2). In vitro antagonism against R. solani was evaluated using pre-colonized plates and filtrates. T. asperellum TCal multiplied on a maize substrate, reaching 1.47 × 10⁹ conidia g⁻¹. Formulations containing 12% conidia maintained more than 1.18 × 10⁹ conidia g⁻¹ after 90 days of storage at 19–24 °C and 1.21 × 10⁹ at 4 °C, all with viability exceeding 95%. In greenhouses, these formulations significantly reduced the severity of disease caused by R. solani, with control efficiencies between 57.5% and 58.3%. These formulations will facilitate the transport, storage, and commercial use of Trichoderma as a biological control agent.

Keywords: biological control; formulation; kaolin; bentonite; shelf life.

Recibido: 25-01-2026.

Aceptado: 18-08-2026.

Trichoderma es un género de hongo ampliamente distribuido a nivel mundial, presente en diversos ecosistemas y zonas climáticas, desde regiones templadas y tropicales hasta ambientes extremos como la Antártida y la tundra (Gams & Bissett, 1998). Coloniza principalmente madera en descomposición y residuos vegetales, y con frecuencia actúa como endófito en plantas leñosas, estableciendo interacciones benéficas con sus hospederos (Ávila-Oviedo et al., 2026). Es el sexto género de hongo más citado en las publicaciones de la base de datos de Web of Science por su impacto en estudios de Micología y significado económico (Bhunjun et al., 2024).

Trichoderma ha sido identificado como uno de los antagonistas más eficaces contra Rhizoctonia solani, un patógeno de suelo ampliamente distribuido que ocasiona pérdidas importantes en diversos cultivos (Abo-Elyousr et al., 2026; Vashisht et al., 2026; Halifu et al., 2020; Harries et al., 2026). En algodón, R. solani, particularmente el grupo AG-4, provoca damping-off en pre y post emergencia, reduciendo el establecimiento de plántulas y el rendimiento potencial (Heflish, 2020). En Estados Unidos, las enfermedades tempranas asociadas a este patógeno redujeron el rendimiento entre 2 y 3 % anual (Goulart et al., 2021), aunque su impacto aumenta bajo condiciones ambientales favorables y prácticas de manejo deficientes (Ahumada, 2026). En otros cultivos como alfalfa y soya, las pérdidas pueden alcanzar entre 20% y 60% (Akber & Fang, 2024; Sahu et al., 2024).

En el Perú, el cultivo de algodón tuvo una participación importante en el Producto Bruto Interno (PBI); sin embargo, su importancia económica ha disminuido progresivamente. Entre 2007 y 2018, su contribución al PBI pasó de 3,8% a 0,5%, debido al incremento de las importaciones de fibra, la volatilidad de los precios internacionales, la desventaja competitiva frente a países que utilizan semillas transgénicas y el uso progresivo de fibras sintéticas (MINAGRI, 2019; Khan et al., 2020).

En este contexto, R. solani representa una limitante adicional para el cultivo, ya que reduce la población de plantas cuando la humedad del suelo favorece su desarrollo (Ajayi-Oyetunde & Bradley, 2018), lo que conduce al uso frecuente de fungicidas químicos. Aunque en el Perú no existen estimaciones precisas de las pérdidas ocasionadas por este patógeno, los daños son particularmente severos en suelos de textura pesada, donde disminuye significativamente el número de plantas establecidas.

En el Perú, la regulación sobre el uso de plaguicidas químicos se aplica de manera más estricta en cultivos de agroexportación que en aquellos destinados al mercado interno, lo que, junto con la inadecuada disposición de envases, puede comprometer la sostenibilidad agrícola (Sandoval et al., 2023). Asimismo, la exposición crónica a plaguicidas representa un riesgo para la salud humana, especialmente en trabajadores agrícolas y poblaciones rurales (Honles et al., 2026). En este contexto, el empleo de formulados a base de Trichoderma representa una alternativa viable y ambientalmente segura para reducir la dependencia de plaguicidas sintéticos y mitigar sus efectos negativos, manteniendo al mismo tiempo la eficacia en el manejo de R. solani y otros patógenos del suelo.

En las últimas décadas, la demanda de agentes de biocontrol basados en Trichoderma ha aumentado significativamente, impulsando la necesidad de garantizar su calidad, estabilidad y eficacia mediante la identificación molecular de cepas nativas (Cai & Druzhinina, 2021), la estandarización de los procesos de producción y el desarrollo de formulaciones adaptadas al entorno de aplicación. Entre estas, los polvos humectables destacan por su facilidad de manejo y aplicación (Kumar et al., 2023). Sin embargo, en diversas regiones del Perú aún predominan sistemas artesanales de producción basados en sustratos sólidos, como arroz y otros cereales, que, aunque son económicos y de fácil implementación (Arévalo et al., 2017), presentan limitaciones en estabilidad, vida útil, transporte y comercialización, reduciendo la eficacia del agente de control biológico.

El desarrollo de formulaciones sólidas requiere la deshidratación y cosecha de propágulos, principalmente conidias (Hamrouni et al., 2026), y su incorporación en materiales portadores inertes, como caolín, vermiculita, bentonita, talco etc. (Kumar et al., 2023; Martínez et al., 2023). En Perú, estas arcillas están ampliamente disponibles como subproductos de la actividad minera (Faustino et al., 2023; Mamani et al., 2022). Sin embargo, no existen estudios sobre formulaciones en polvo humectable con materiales locales, y uno de los principales desafíos tecnológicos es minimizar la pérdida de viabilidad de los propágulos durante el almacenamiento, con una vida útil deseable de 8 a 12 meses (Kumar et al., 2014).

Hasta julio de 2021, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) registró 130 bioplaguicidas comerciales en el país, de los cuales Trichoderma representó el 16 %, ocupando el segundo lugar después de Bacillus thuringiensis. Aunque su uso en la agricultura de exportación ha aumentado, esta situación evidencia una brecha tecnológica entre la creciente demanda de bioinsumos y la disponibilidad de formulaciones estables y eficaces de Trichoderma adaptadas a las condiciones locales.

En este contexto, el objetivo del presente estudio fue desarrollar formulaciones tipo polvo humectable a partir de aislados peruanos de Trichoderma asperellum, empleando caolín y bentonita como portadores, evaluar su vida útil bajo diferentes condiciones de almacenamiento y determinar su eficacia en el control de Rhizoctonia solani en plántulas de algodón en condiciones de invernadero.

Obtención de Rhizoctonia solani y prueba de patogenicidad

Rhizoctonia solani se aisló a partir de plántulas de algodón de 15 días con síntomas de cancros y lesiones hundidas en la base del tallo, recolectadas en Alto Larán, Chincha, Perú (13°26′41″ S; 76°06′47″ W). Fragmentos de 0,5–1,0 cm de tejido necrosado se desinfestaron con hipoclorito de sodio (300 ppm), después de enjuagar y secar se transfirieron en placas Petri con medio PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm). Las placas se incubaron a 25 °C durante 72 h. Los aislados se evaluaron preliminarmente por sus características macroscópicas de crecimiento y posteriormente se describieron sus características morfológicas de hifa según los criterios de Parmeter & Whitney (1970) y Ajayi-Oyetunde & Bradley (2018).

Para la prueba de patogenicidad se utilizó una mezcla 1:1 de arena de río y suelo agrícola de textura franco arenosa, desinfectada con formol al 2 % durante 7 días. Después de la ventilación el sustrato se transfirió a bolsas plásticas negras de 4,5 kg, en las que se sembraron cinco semillas de algodón cv. Tanguis. A los 12 días, en la base del tallo se inocularon el patógeno, removiendo el sustrato entre 2 - 5 cm de profundidad e incorporando el contenido de una placa Petri con R. solani de 7 días por maceta. Las plantas se mantuvieron entre 21 - 25 °C, con 70–90 % de humedad relativa y riego inter diario a capacidad de campo.

Obtención de aislados de Trichoderma y descripción

Se recolectaron 12 muestras de suelo rizosférico de plantas de algodón (Gossypium barbadense L.), a una profundidad de 10–20 cm, en campos de cultivo ubicados en Chincha, Ica (13°29′35,5″ S, 76°09′49,0″ W), y Cañete, Lima (13°05′19,3″ S, 76°23′15,6″ W), Perú. A partir de estas muestras se aislaron cepas de Trichoderma.

En el laboratorio, las muestras se suspendieron en agua destilada estéril y se prepararon diluciones seriadas hasta 10⁻³. Posteriormente, se inocularon 20 μL de la dilución 10⁻³ en placas de Petri que contenían medio selectivo modificado para Trichoderma (TSM) modificado, según Elad et al. (1981), sin pentacloro nitrobenceno ni dimetil amino bencenosulfónico. Se adicionaron 50 ppm de cloranfenicol, 50 ppm de captan (Captan 50®) y 250 ppm de metalaxil (Fitoklin®) por litro de medio estéril.

Los aislados de Trichoderma obtenidos de suelos de Cañete (TCal, TCa2) y Chincha (TChl, TCh2) se cultivaron en medio PDA. Tras 7 días, se identificaron hasta el nivel de género basado en características morfológicas de color, olor, aspecto de la colonia, tasa de crecimiento, conformación del conidióforo, forma de células conidiógenas y conidias, utilizando los criterios morfológicos descritos por Gams & Bissett (1998).

Cribado in vitro de Trichoderma

a. Velocidad de crecimiento en PDA

Los aislados obtenidos fueron multiplicados en medio PDA. Se evaluó la velocidad de crecimiento micelial mediante el diámetro de la colonia cada 12 horas. En la evaluación se incluyeron especies conocidas T. viride, T. harzianum y T. virens, proporcionadas por el Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Perú (SENASA) a través del Programa Nacional de Control Biológico.

b. Selección mediante placas pre colonizadas

Se empleó el método descrito por Leiva et al. (2020). Para ello, R. solani se cultivó en medio PDA en placas Petri de 9 cm de diámetro, tras 7 días, se inoculó con Trichoderma de 7 días crecida en PDA, colocando un trozo de 0,5 x 2,5 cm en un extremo de la placa, sobre la colonia del patógeno, de manera invertida para asegurar el contacto entre las hifas del antagonista y el patógeno. Se realizaron 5 réplicas por aislado. Las placas se incubaron a 25 °C. Se midió la longitud de crecimiento micelial de Trichoderma extrayendo rodajas sucesivas con un sacabocado de 6 mm de diámetro desde el extremo opuesto al inóculo. La longitud de crecimiento del antagonista y la inhibición de R. solani se calcularon multiplicando el diámetro por el número de trozos, y se determinó la inhibición del patógeno mediante la fórmula: PI = (CT x 100) / N; donde PI es porcentaje de inhibición, CT es crecimiento de Trichoderma, N es número de muestras o rodajas por cada réplica.

c. Selección por inhibición micelial con filtrados de Trichoderma

La evaluación se realizó mediante la técnica de cultivo envenenado con filtrados de Trichoderma (You et al., 2016). El antagonista se cultivó en caldo papa dextrosa (PD) estéril (250 g de papa blanca y 20 g de dextrosa L⁻¹) contenido en matraces, inoculados con dos discos de PDA (2 × 2 cm) con micelio de 5 días. Los cultivos se incubaron a 21–25 °C, con agitación a 150 rpm durante 7 días. La biomasa se separó mediante filtración (Millipore, 0,45 µm) y centrifugación a 4000 rpm por 10 min. El sobrenadante se calentó en baño maría a 60 °C durante 2 h y se incorporó al medio PDA hasta una concentración final de 40 % (v/v). R. solani se inoculó en placas Petri suplementadas con el filtrado mediante discos miceliales; el control consistió en PDA sin filtrado. Las placas se incubaron a 25 °C durante 5 días. El diámetro de la colonia se registró a las 48, 72 y 96 h, y el porcentaje de inhibición se calculó como: Inhibición (%) = [(A − B)/A] × 100, donde A corresponde al crecimiento en el control y B al crecimiento en cada tratamiento.

Identificación molecular de Trichoderma

Los aislados monoespóricos de Trichoderma (TCal y TCh2) se cultivaron en PDA durante 4 días a 24 °C. El ADNr de la región ITS se extrajo con el kit Extracta Plus DNA 50 RXN (Quantbio Inc., EE. UU.) y se amplificó por PCR usando los primers ITS1 e ITS4 (White et al., 1990), con temperaturas de anillamiento de 61 y 55 °C, respectivamente. Los amplicones se secuenciaron por el método Sanger (Macrogen, EE. UU.).

Posteriormente, los electroferogramas se editaron y las secuencias se alinearon en MEGA (MUSCLE) junto con secuencias de referencia. Las secuencias se contrastaron con la base de datos NCBI mediante BLAST, considerando porcentaje de cobertura, identidad y E-valor como criterios de identifi-cación. El análisis filogenético se realizó en IQ-TREE v.2 mediante máxima verosimilitud con 1000 réplicas, y el árbol se editó en iTOL v.6.

Multiplicación de Trichoderma en sustrato sólido

El aislado identificado como Trichoderma asperellum TCal se multiplicó en maíz amarillo partido (Dekalb®), hidratado con 250 mL de agua destilada estéril por 750 g, según la metodología de Castillo-Arévalo et al. (2025) con modificaciones. Para obtener el inóculo Trichoderma primero se multiplicó en placa Petri con PDA durante 5 días, a la cual se añadió 20 mL de agua destilada estéril, obteniéndose 15 mL de suspensión de conidias con una concentración de 2 x 10⁸ conidias/mL. Esta suspensión se añadió a un frasco conteniendo 500 mL de solución nutritiva (melaza de caña de azúcar al 3% y levadura de cerveza al 0,5%), seguidamente se incubó en agitación a 150 rpm por cuatro días a 19-24 °C. Finalmente 50 mL del inóculo obtenido se incorporó en cada bolsa con sustratos, incubándose a 25 °C durante 10 días para su desarrollo.

Formulación de T. asperellum en polvo humectable (PH)

Los conidios de T. asperellum TCal, obtenidos desde sustrato sólido de maíz amarillo, se utilizaron para formular cuatro prototipos PH (correspondiente a una formulación tipo polvo mojable), para ello, se mezclaron con caolinita (Caolín COMACSA®), bentonita sódica y almidón de papa, en las proporciones indicadas en la Tabla 1. La caolinita y la bentonita sódica se esterilizaron mediante calor seco a 90 °C durante 4 h, mientras que el almidón de papa se esterilizó de forma fraccionada en dos ciclos de 2 h a 70 °C.

Tabla 1

Componentes de los formulados polvos mojables de Trichoderma asperellum

Materia inerte		*Conidios de Trichoderma* (%)**
Tipo de Portador	Cantidad (%)	*Conidios de Trichoderma* (%)**
Caolinita	89,0	6,0
Caolinita	83,0	12,0
Bentonita	89,0	6,0
Bentonita	83,0	12,0
Almidón de papa	5,0	-

Para cosechar las conidias desde el sustrato de maíz amarillo partido, éstas se deshidrataron con un deshumidificador Miray DM-208 hasta alcanzar una humedad relativa del 25% a 15 °C durante 4 días, posteriormente las conidias se extrajeron mediante agitación rotatoria a 250 rpm y adaptado con tamices de 300 y 150 mesh, a continuación se homogenizaron con las arcillas mediante una mezcladora rotatoria a 60 rpm durante 60 minutos, los formulados se almacenaron en frascos de polietileno de alta densidad durante 90 días, a 4 °C y otro grupo a 19-24 °C. Para la evaluación de la estabilidad (concentración, viabilidad, pH, humec-tabilidad y suspendibilidad) de los formulados obtenidos, se almacenaron cinco frascos por cada prototipo, los cuales fueron evaluados cada 30 días.

Concentración y viabilidad de conidias en el formulado PH

La concentración de conidios se determinó en una suspensión de conidias a una dilución 1:1000 v/v obtenida mediante diluciones seriadas, a partir de 10 g de polvo mojable mezcladas en 90 mL agua destilada y estéril con Tween 80 al 0,1%. Para el conteo de conidias se utilizó la cámara de Neubauer. Para calcular la viabilidad de conidios se agregó 0,.2 mL de la dilución en una placa Petri con PDA, contando el número de conidias con formación de tubo germinativo a las 18 horas de incubación a 24 °C, expresado en porcentaje.

pH, humectabilidad y suspendibilidad

El pH se determinó en una solución homogenizada resultante de mezclar 10 gramos de PH en 100 mL de agua destilada con un equipo Analizador Multiparámetro JP SELECTA MP-2006. La humec-tabilidad se evaluó según lo establecido en CIPAC MT 53.3 y la suspendibilidad de acuerdo con CIPAC MT 15.1, para formulaciones tipo polvo mojable.

Bioensayo con los formulados PH

Para conocer la eficacia de control de “Chupadera fungosa” causada por R. solani, se aplicó suspen-siones del PH en plantas de algodón Gossypium barbadense Cv. Tanguis inoculadas con el patógeno y crecidas en macetas de bolsa negra con mezcla de suelo agrícola de textura franco arenoso y arena de río en una proporción 1:1, v/v, desinfestada con formol al 2%. Las dosis de aplicación se detallan en la Tabla 2. La severidad de daño por R. solani se evaluó empleando la escala de grados propuesta por Goulart (2018). Con los datos de grados se determinó la severidad de daño utilizando la fórmula de Towsend & Heuberger (1943).

Tabla 2

Tratamientos con formulados de T. asperellum TCal en el control de R. solani en plantas de algodón

Código de Tratamiento

Ingrediente activo

N° conidias /maceta

(%)

Conidios/g

C12

C06

B12

B06

Ctrl1

Ctrl2

12,0

06,0

12,0

06,0

0,1

1,21x10⁹ ^y 0,62x10⁹

1,23x10⁹

0,62x10⁹

1,08x10⁸

0,55x10⁸

1,10 x 10⁸

0,55x10⁸

Nota: ^y concentración del producto formulado. C = caolín; B = bentonita; los números (12 y 6) indican la concentración (%) de conidias. CQ = benomilo (0,1%); Ctrl1 = control inoculado con R. solani; Ctrl2 = testigo absoluto (sin patógeno ni tratamiento).

Propagación e inoculación de R. solani

El patógeno se propagó en sustrato cáscara de arroz (CA) suplementada con una solución nutritiva PD. Se utilizaron 150 mL de esta solución y 500 g de cáscara por bolsa polipropileno; luego de esterilizar se incorporó un trozo (2 x 2 cm) de medio PDA con hifas de R. solani y se incubó a 24 °C durante 10 días.

El sustrato de las macetas utilizado tuvo las mismas características que el utilizado en la prueba de patogenicidad. Las semillas de algodón fueron desinfectadas en una solución de NaClO al 1% durante 5 minutos, luego se enjuagaron dos veces con agua destilada. Se sembraron 5 semillas por maceta. Las condiciones ambientales de bioensayo fueron 19 – 24 °C, 75% - 92% de humedad relativa. En plantas de 15 días, se inoculó 10 gramos de CA colonizado con R. solani en la zona del cuello de plantas, cubriéndose adicionalmente 2 cm de espesor con CA libre de patógeno para mantener la humedad del suelo. Las macetas se regaron manualmente manteniendo la humedad del sustrato en estado capacidad de campo.

Aplicación del formulado Trichoderma

De los prototipos PH se obtuvieron suspensiones de conidias (Tabla 2). Se mezclaron 1,5 g de PH en 500 mL de agua destilada. Después de homoge-neizar, se asperjaron 30 mL de la mezcla en la zona de la base de tallo de cada maceta utilizando una atomizadora Truper® de 1 L de capacidad 3 días después de la inoculación del patógeno. Se utilizó benomilo (Farmate®, Farmagro) como referencia.

Diseño estadístico

Los datos de crecimiento e inhibición micelial y severidad se analizaron bajo un diseño comple-tamente al azar (DCA), con cinco réplicas por tratamiento y una placa Petri como unidad experimental. Para la evaluación de concentración de conidias, viabilidad, pH, suspendibilidad y humectabilidad del PH se utilizó un DCA con arreglo factorial. Previamente, los datos se sometieron a la prueba de normalidad de Shapiro–Wilk y homogeneidad de varianzas (p = 0,05). El análisis de varianza y la prueba post hoc de Tukey se realizaron con el software Minitab 19.

Aislamiento de Rhizoctonia solani y prueba de patogenicidad

Desde tallos de plántulas de algodón afectadas por “chupadera fungosa” en el cuello, se aisló el hongo R. solani en medio PDA. Al principio la colonia mostró micelio claro, que luego se tornó marrón con el tiempo y creció rápidamente, de 1 a 2 cm por día. Bajo el microscopio, se observaron características morfológicas específicas: hifas con septos bien desarrollados, diámetro de 8 a 11 µm, constricción en los puntos de ramificación y en forma de “T”, sin formación de conidias. Estas características coinciden con las descritas por Parmeter & Whitney (1970) y Ajayi-Oyetunde & Bradley (2018), y se confirma la identificación como R. solani para el aislado obtenido desde plántulas de algodón provenientes de Chincha Perú. En la Figura 1 se presenta la imagen de hifas y la cancrosis.

Figura 1. Hifas de R. solani aisladas de plántulas de algodón; a la derecha, cancro en el talluelo.

Rhizoctonia solani, aislada de talluelos de algodón procedentes de Chincha Perú, mostró ser patogénica en invernadero, causando síntomas similares a los observados en el campo. A partir del cuarto día después de la inoculación aparecieron los primeros síntomas, algunas plantas murieron debido a un cancro severo en el cuello. Según la escala de Goulart (2018), el daño fue de moderado a severo, con lesiones hundidas de color marrón y una coloración rojo púrpura en la base del tallo, coincidiendo con descripciones de Ajayi-Oyetunde & Bradley (2018). De los tallos con cancrosis se re aisló el mismo patógeno.

Las enzimas poligalacturonasa (PG), pectin metil esterasa (PME) y celulasas son factores deter-minantes en la degradación de las pectinas y celulosa de la pared celular vegetal, ocasionando necrosis en los tejidos afectados. En R. solani, se ha demostrado que la expresión de los genes que codifican estas enzimas se induce fuertemente durante las primeras etapas de infección, favoreciendo la colonización y el avance de la pudrición radicular (Majumdar et al., 2022). Este mecanismo explica la cancrosis observada en el cuello de plántulas de algodón, donde la acción enzimática debilita las paredes celulares y facilita la invasión del patógeno.

Aislamiento e identificación molecular de Trichoderma

Se aislaron 4 cepas de Trichoderma en medio TSM, todas las colonias mostraron color verde. Los aislados de Cañete fueron denominados TCal y TCa2, los de Chincha como TChl y TCh2. TCal tuvo crecimiento rápido, micelio efuso, color verde oscuro y olor a coco, TCa2 creció más lentamente, tenía una colonia compacta, color verde olivo y produjo pigmentación amarilla en PDA. TChl presentó color verde oscuro, micelio efuso, esporulación densa y olor a coco, TCh2 creció más rápido que TChl, también color verde oscuro y olor a coco. Los aislados TCal y TCh2 formaron rápidamente colonias algodonosas con abundante esporulación, cubriendo placas Petri de 9 cm en 4-5 días. Los cuatro aislados presentaron conidióforo con eje principal y ramificación primaria y secundaria, fiálides en forma de botella, simples, o dispuestas en pares, verticiladas, conidias unicelulares color ligeramente verde, ovoide, pared lisa, formando paquetes alrededor de las fiálides. Los cuatro aislados pertenecen al género Trichoderma de acuerdo con las características descritas por Gams & Bissett (1998).

De los aislados TCal y TCh2, (con buen efecto antagónico in vitro contra R. solani), se extrajeron ADN de la región ITS, la amplificación por PCR de las secuencias mostró fragmentos de aproximadamente 500 pb; se informa que Trichoderma tiene entre 300 a 600 pb en la región ITS (Cai & Druzhinina, 2021). Las secuencias de estas dos cepas alineadas en el BLAST del NCBI revelaron que ambos aislados tienen un 100% de identidad con T. asperellum. Para TCal, la cobertura fue del 99% con la accesión MT529873, para TCh2 fue del 100% con la accesión MT126695 del GenBank.

El análisis filogenético (Figura 2) mostró que TCal y TCh2 están estrechamente relacionados con otras cepas de T. asperellum, como las accesiones MT529873 y KF425754, GU198317 y GU198310, formando un grupo monofilético con un nodo de bootstrap del 97 %. Esto confirma que los aislados de Cañete (TCal) y Chincha (TCh2) son similares a T. asperellum.

El género Trichoderma se caracteriza por su rápido crecimiento de color verde, y muchas especies del clado Trichoderma tienen olor a coco, por lo que son fáciles de reconocer (Mendoza-Mendoza et al., 2024). Los estudios filogenéticos recientes en Trichoderma han demostrado que la región ITS, aunque ampliamente utilizada como marcador molecular, puede presentar una resolución limitada para discriminar especies estrechamente relacionadas. Por ello, se recomienda el empleo complementario de regiones codificantes como el factor de elongación de la traducción 1-α (tef1) y la subunidad 2 de la ARN polimerasa II (rpb2), que proporcionan mayor capacidad de resolución en la identificación y delimitación de especies (Cai et al., 2022; Jin et al., 2026).

Velocidad de crecimiento del micelio de aislados de Trichoderma

Los aislados TCal y TCh2, junto a T. viride, T. harzianum y T. virens fueron evaluados en PDA a 25°C a intervalos de 18, 36, 48, 69 y 87 horas. El aislado TCal mostró el crecimiento más rápido, seguido por TCh2, cubriendo la placa Petri de 9 cm en 87 horas, T. harzianum lo hizo después de 90 horas. El aislado TCa2 mostró un crecimiento más lento, cubriendo la placa en 5 a 6 días. En la Figura 3 se compara la tasa de crecimiento micelial. Los aislados TCal y TCh2 (T. asperellum) mostraron la mayor velocidad de crecimiento, con 1,2 cm/día, superando a T. harzianum que creció a 1,18 cm/día. Miguel-Ferrer et al. (2021) reportan que T. harzianum y T. koningiopsis crecieron a 1,32 y 1,23 cm/día, respectivamente. Este crecimiento rápido es una característica deseable en controladores biológicos.

Concentración y viabilidad de conidias en PM

El aislado TCal multiplicado en sustrato maíz amarillo logró 1,47 × 10⁹ conidias g⁻¹, se extrajo en promedio 13,8 gramos de conidias por kilo de sustrato, con lo cual se formuló prototipos PH. En la Tabla 3 se presenta el promedio de conidias g⁻¹ de PH; no hubo variación significativa (p < 0,05) durante el almacenado en temperatura fría y ambiental en 90 días entre diferentes tipos de arcillas, la concentración de conidias en el tiempo se mantuvo constante. Los hallazgos de esta investigación son similares a estudios previos en formulados con talco, como el de Bhat et al. (2009), que muestra una reducción no significativa de conidios en formulaciones similares hasta los primeros 60 días.

En caolín con 6 % de ingrediente activo al momento de la formulación se obtiene 0,625 x 10⁹ conidias g⁻¹, después de almacenar a 4 y 19 - 24 °C por 90 días resultó en 0,614 y 0,611 x 10⁹ conidias g⁻¹ respectivamente; con 12 % de ingrediente activo se consiguió 1,21 x 10⁹ conidias g⁻¹, después de almacenar en 4 y 19 - 24 °C resultó en 1,20 y 1,19 x 10⁹ conidias g⁻¹ respectivamente. Con bentonita mantuvo la misma tendencia, los valores se pueden ver en la Tabla 3. Los resultados evidencian que una mayor cantidad de conidios mejora la concentración de ingrediente activo en el PH; aunque no hay datos de investigación disponibles sobre formulación en Perú para T. asperellum como polvo mojable, existen productos comerciales en el mercado nacional registrados en SENASA con concentraciones entre 10⁸ y 10⁹ conidias g⁻¹. Bhat et al. (2009) reportan que una formulación de T. harzianum en talco comenzó con 3,2 x 10⁸ conidias g⁻¹, después de almacenar 90 días en bolsas de polipropileno bajó a 1,2 x 10⁸ conidias g⁻¹. La concentración de 1,2 × 10⁹ conidias g⁻¹ obtenida en el presente estudio es comparable con la reportada para otros bioformulados de Trichoderma, cuyos contenidos iniciales se sitúan generalmente en el orden de 10⁸–10⁹ UFC.g⁻¹ (Mulatu et al., 2021; Choudhary et al., 2023; Kumar et al., 2023).

El análisis de porcentaje de germinación de conidios no mostró diferencia significativa a los 90 días de almacenamiento a 4 °C; sin embargo, a temperatura 19 - 24 °C, la viabilidad disminuyó ligeramente desde los 60 comparado con el primer día. No se observó interacciones significativas entre el tipo de arcilla y la concentración del ingrediente activo (6% y 12%) en ambas temperaturas de almacenamiento.

Los resultados muestran que almacenar el producto a temperatura ambiente reduce el porcentaje de germinación, afectando su viabilidad; a 90 días, en el formulado de bentonita con 12% de conidias bajó de 98,39% a 95,04%, en el formulado con 6% se redujo de 98,37% hasta 95,65%. En caolín con 12% de conidias, se redujo de 97,20% a 95,99%. En la concentración del 6% de conidias mantuvo la misma tendencia.

Varios investigadores obtuvieron formulados utilizando arcillas y otros materiales como portadores de esporas. Santos et al. (2012) formularon T. koningiopsis y T. asperellum empleando silicato de aluminio y almidón como granulado dispersable, logrando una vida útil de hasta 14 meses cuando almacenó a 8 y 18 °C, pero cuando almacenó a 28 °C se redujo significativa-mente entre 3-5 meses.

Pirttilä et al. (2021) mencionan que los formulados biológicos suelen ser afectados negativamente en su vida útil por las condiciones de almacenamiento y transporte post formulación, lo cual podría reducir su eficacia. Kumar et al. (2023) resaltan que la calidad de un formulado microbiano depende de la densidad de propágulos y de su capacidad para mantenerse viable en el tiempo, señalando además que portadores como talco, alginato y aceites vegetales presentan diferencias importantes en estabilidad y vida útil.

Choudhary et al. (2023) demostraron que la formulación en talco permite conservar la viabilidad de T. asperellum por 12 meses, con mayor estabili-dad a bajas temperaturas (0 – 4 °C), confirmando que el talco es un portador químicamente inerte y adecuado para bioformulaciones. En productos elaborados artesanalmente en sustratos sólidos como arroz y maíz, la viabilidad de los propágulos disminuye rápidamente debido a la degradación del almidón por acción de las enzimas de Trichoderma, acompañado de la actividad del agua, transfor-mándose el sustrato en una masa pastosa propensa a contaminación durante el almacenamiento, lo que dificulta su uso efectivo en biocontrol. Las formulaciones con caolín, bentonita y otras arcillas son económicas y de fácil disponibilidad (Martínez-Medina et al., 2009), facilitan su envasado, almacenaje, transporte y comercialización.

Humectabilidad, suspendibilidad y pH del PH

El tiempo de humectabilidad de todos los prototipos fue menor a 60 segundos después de añadir en agua a temperatura ambiente (21 °C). No se observaron diferencias significativas entre diferentes tipos de formulados después de almacenarlos hasta 90 días. Los tiempos de humectación inicial para bentonita fue de 43,4 a 57,3 segundos, y 56,42 a 51,46 segundos para caolín. Después de almacenar durante 90 días lavariación de la humectabilidad no fue significativa (Tabla 4). Aunque muchos estudios sobre formulaciones de Trichoderma con arcillas no mencionan este aspecto. Perdomo et al. (2021) usaron bentonita para formular Trichoderma, obteniendo un tiempo de humectabilidad superior a un minuto.

La determinación de la humectabilidad busca asegurar que los polvos mojables formulados con talcos o arcillas se dispersen, en menos de un minuto sin agitación y se mantengan en suspensión (FAO y OMS 2022). Las arcillas tienen distintas capacidades de humectación, sus propiedades laminares les confieren una alta afinidad por el agua y capacidad de dispersión. Estudios confir-man que la bentonita hidratada genera dispersio-nes coloidales estables gracias a su estructura de doble porosidad (Vasconcelos et al., 2026), mien-tras que el contenido de agua regula la cohesión y suspensión de partículas (Zheng &, 2025). Estas características explican por qué los portadores arcillas en polvo mojable favorecen una dispersión rápida y una suspensión prolongada en agua.

Los valores de suspendibilidad logrados en los formulados fueron satisfactorios (Tabla 4). Al momento de la formulación, los valores fueron entre 81% – 83%, después de 90 días de almacena-miento a 4 °C se mantuvo entre 81,74% – 83,8%, y 82,3% – 84% a 19 - 24 °C; es decir, no variaron significativamente durante el tiempo de almace-nado. Los plaguicidas PM deben dispersarse completamente y mantener al menos 60% del ingrediente activo en suspensión después de 1 min, es decir la sedimentación debe ser lenta.

Marzban et al. (2021) formularon Bacillus thuringiensis con caolín y tierra diatomea, obteniendo una suspendibilidad de entre 20% y 67%, relativamente baja, aunque el tiempo de humectabilidad fue de 11 a 19 s. Por otro lado, Perdomo et al. (2021) lograron obtener formulados polvos mojables a base talco, bentonita, almidón de yuca y conidias de T. asperellum consiguiendo una suspendibilidad de 97,9% y 97,2% después de almacenar a 4 y 30 °C durante 6 meses. En este estudio, la humectabilidad y suspendibilidad del prototipo PM no mostraron cambios significativos durante el periodo de almacenamiento en las dos condiciones de temperatura. La prueba de viabilidad de conidias después del almacenamiento mantuvo estándares aceptables comparado con estudios de otros investigadores. La caolinita y la bentonita tienen diversas aplicaciones industriales debido a su no toxicidad para la salud humana. Sus partículas finas permiten incluir en formulaciones de varios plaguicidas polvo mojables.

Las conidias de Trichoderma spp. son hidrofóbicas porque su superficie está recubierta por hidrofobinas (Cai et al., 2021), que forman una capa que repele el agua y favorece su dispersión aérea. Estas proteínas reducen fuertemente la tensión superficial del agua y produce superficies muy poco mojables (Medina & Rangel, 2025), esta característica influye a que las formulaciones PM no se disuelva rápidamente en agua, por lo que requiere un surfactante en el formulado.

Severidad de la enfermedad por R. solani bajo tratamientos con formulados PH

La severidad del daño en las plantas tratadas con formulados PH de Trichoderma fueron leves, los tratamientos biológicos más efectivos fueron las que contenían 12% de conidias, mostrando entre 36,6 y 38,3 % de severidad. En contraste, el grupo testigo inoculado mostró una severidad del 85%, con síntomas de cancros prominentes (1,0 -2,5 cm), estrangulamiento en el cuello, marchitez severa y muerte una semana después de la inoculación. Las plantas tratadas con PH no mostraron signos de marchitez, aunque presentaron lesiones leves y continuaron su desarrollo, no presentó diferencia en altura (Tabla 5 y Figura 6). Las plantas tratadas con benomyl mostraron la incidencia y severidad más baja, con cancros muy pequeños.

Tabla 5

Severidad, eficacia y altura de planta en el control de R. solani con formulados de T. asperellum polvo humectable en plantas de algodón

Trat	Severidad de daño (%)	Altura de planta (cm)	Eficacia de control*(%)
C06	53,67 b	28,43±0,69 ab	36,9 b
B06	55,00 b	29,49±2,59 ab	35,3 b
C12	36,13 c	30,15±0,71 ab	57,5 c
B12	35,43 c	30,36±1,08 ab	58,3 c
CQ	18,33 d	30,66±1,11 a	78,4 d
Ctrl 1	85,00 a	27,85±1,52 b	0,0 a
Ctrl 2	0,00 e	29,87±0,99 ab	100,0 e

Nota. C = caolín y B = bentonita; los números (6 y 12) indican el porcentaje de conidias del formulado. CQ = control químico (benomilo); Ctrl1 = control inoculado con R. solani; Ctrl2 = testigo absoluto (sin patógeno ni tratamiento). *Calculado con la fórmula de Abbott (1925), ((Stest-Ti)/(Stest)) x100, S = severidad de daño, Ti= iésimo tratamiento, test= testigo.

Figura 6. Crecimiento de algodón tratado con formulado polvo humectable de T. asperellum. A: Formulado en caolín + 12 % de conidias, B: bentonita +12 % conidias, C: testigo.

Resultados en el mismo sentido hallaron Martínez-Medina et al. (2009), reportando que plantas de melón tratadas con formulados de T. harzianum en bentonita y vermiculita contra Fusarium tuvieron una incidencia entre 76% y 46%, pero su creci-miento y peso fresco permanecieron normales. En nuestro estudio, la presencia de leves cancros observados en plantas de algodón tratadas con Trichoderma probablemente se debió a que su aplicación se realizó tres días después de la inoculación con R. solani, momento en el que ya se habían manifestado los primeros síntomas de la enfermedad.

Existen diversos métodos para controlar R. solani, como el uso de productos químicos, sin embargo, está documentado su efecto negativo en el ecosistema agrícola; el control con Trichoderma, es ampliamente estudiado como alternativa ecológica (Avila-Oviedo et al. 2026; Majumdar et al., 2022). Trichoderma actúa mediante micoparasitismo, antibiosis y promoción del crecimiento vegetal (Irfan et al., 2026; Jiménez Bremont et al., 2026).

Eficacia de control

Los tratamientos biológicos con Trichoderma en formulaciones al 12% de conidios en bentonita y caolín demostraron mayor eficacia de control sobre R. solani, con tasas de control del 58,3% y 57,5%, respectivamente (Tabla 5 y Figura 7); estos resultados fueron significativamente mejores (α ≤ 0,05) en comparación con formulaciones PH con 6% de esporas. La eficacia depende de factores como la concentración de conidias, su viabilidad.

La concentración conidial del 12% en el PH (equivalente a 1,2 x 10⁹ UFC/g) supera el mínimo recomendado por Kumar et al. (2014) (2 x 10⁶UFC/g), está dentro del rango general empleado en Europa de 10⁵ a 10⁹ UFC/g (Natsiopoulus et al., 2022; Sokhadani et al., 2016). Martínez et al. (2023) refieren que los productos biológicos exitosos deben estar entre10⁷ a 10¹⁰ UFC/g. En Perú, la regulación de pesticidas químicos y biológicos está cubierta por el DS-001-2015-MINAGRI, que no especifica concentraciones mínimas para los formulados biológicos, lo que ha llevado a una variabilidad en la calidad de los productos, incluyendo problemas con la viabilidad y pureza de los propágulos.

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Portador	% i.a.	Cantidad de Conidios (×10⁹ g⁻¹)			Germinación de conidios (%)
Portador	% i.a.	Inicio	4 °C	19- 24 °C	Inicio	4 °C	19- 24 °C
Caolín	6	0,625 a	0,614±0,02a	0,611±0,05a	98,25 a	96,80±0,87 a	95,51±1,28b
Caolín	12	1,212 b	1,203±0,24b	1,192±0,13b	97,20 a	97,03±1,86 a	95,99±1,84b
Bentonita	6	0,629 a	0,616±0,0 a	0,613±0,04a	98,37 a	97,60±0,89 a	95,65±0,77b
Bentonita	12	1,226 b	1,209±0,06b	1,162±0,08b	98,39 a	96,43±1,88 a	95,04±1,23b

Portador inerte		Suspendibilidad (%)			Humectabilidad (s)			pH
Portador inerte	% i.a.	Inicio	4 °C	19-24 °C	Inicio	4 °C	19-24 °C	Inicio	4 °C	19-24 °C
Caolín	6	81,01	82,75	83,50	56,42	50,02	52,25	6,68	6,66	6,67
Caolín	12	82,25	81,74	82,25	51,46	57,50	56,75	6,64	6,66	6,65
Bentonita	6	82,75	83,8	84,00	43,4	50,25	49,75	6,71	6,70	6,71
Bentonita	12	83,00	82,50	83,75	57,31	53,50	49,25	6,66	6,65	6,66