Organogénesis indirecta en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) usando dos tipos de explantes

Indirect organogenesis in strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using two explant types

Gabriela Alexandra García-Carrasco¹; Arturo AdolfoArbulú-Zuazo^2*; Henry Robles-Cueva²;

Humberto Rivera-Calle¹; Luis Conrado Guzmán-Farfán³

1 Universidad Nacional de Piura, Piura, Perú. Escuela Profesional de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias. Ciudad Universitaria Urb. Miraflores S/N. Castilla. Piura. Perú.

2 Centro de Innovación Productiva y Transferencia Tecnológica Agroindustrial Piura (CITE Agroindustrial Piura), Piura, Perú. Calle Ramón Mugica N°131. Of. Q 209. Urb. San Eduardo I Etapa. Piura. Piura. Perú.

3 Universidad Nacional de Piura, Piura, Perú. Facultad de Agronomía. Ciudad Universitaria Urb. Miraflores S/N. Castilla. Piura. Perú.

* Autor corresponsal: arturo.arbulu@citeagropiura.org (A. A. Arbulú-Zuazo).

ORCID de Autores:

G. A. García-Carrasco: https://orcid.org/0009-0000-3102-1670 A. A. Arbulú-Zuazo: https://orcid.org/0000-0002-5541-0416

H. Robles-Cueva: https://orcid.org/0000-0002-2817-573X H. Rivera-Calle https://orcid.org/0000-0001-8472-2067

L. C. Guzmán-Farfán: https://orcid.org/0000-0002-2780-571X

RESUMEN

La propagación in vitro es importante por generar producción masiva de plantas homogéneas, libres de enfermedades y de gran calidad. El objetivo fue desarrollar un protocolo de organogénesis indirecta en fresa. Se usó dos explantes: hojas cotiledonares e hipocótilo. En desinfección se usaron tres concentraciones de hipoclorito de sodio (0,9; 1,1 y 1,3 %); en inducción a callos, se utilizó el medio basal MS con 2,4 D (0,2 mg^.L^-1 y 1 mg^.L^-1) y BAP (0,1 mg^.L^-1) o TDZ (1 mg^.L^-1); y, en regeneración de brotes, el medio basal MS con BAP (2 mg^.L^-1), TDZ (0,5 mg^.L^-1) y 2,4 D (0,2 mg^. L^-1) o ANA (0,2 mg^. L^-1). El diseño estadístico fue factorial 2x3 Completamente al azar. Los resultados, en hojas cotiledonares e hipocótilo, indicaron que el NaClO al 1,3% fue el más apropiado en desinfección, mientras que, el medio para inducir mayor porcentaje de callos fue con 0,2 mg^. L^-1 2,4 D y 1 mg^. L^-1 TDZ. Los mayores porcentajes de regeneración de brotes en hojas cotiledonares e hipocótilo fueron con los tratamientos de 2,4D y ANA respectivamente. El protocolo obtenido se constituye en un instrumento de valor para futuras investigaciones.

Palabras clave: Callo; micropropagación; regeneración; reguladores de crecimiento.

ABSTRACT

In vitro propagation is important for regenerating mass production of homogeneous, disease-free, and high-quality plants. The objective was to develop an indirect organogenesis protocol in strawberry. It used two explants: cotyledonary leaves and hypocotyls. The disinfection stage used three concentrations of sodium hypochlorite (0.9; 1.1 and 1.3%). Callus induction was carried out using MS basal medium with 2,4-D (0.2 mg^. L^-1 and 1 mg^. L^-1) and BAP (0.1 mg^. L^-1) or TDZ (1 mg^. L^-1). Shoot regeneration used MS basal medium with BAP (2 mg^. L^-1), TDZ (0.5 mg^. L^-1), and 2,4-D (0.2 mg^. L^-1) or ANA (0.2 mg^. L^-1). It was used a completely random statistical design in a 2x3 factorial. For both cotyledonary leaves and hypocotyls, the results indicated that 1.3% NaClO was the most appropriate for disinfection; while the optimal medium for inducing a higher percentage of callus was 0.2 mg^. L^-1 2,4-D and 1 mg^. L^-1 TDZ. The best results for shoot regeneration were the medium supplemented with 0.2 mg^. L^-1 2,4-D for regenerating cotyledonary leaves, and 0.2 mg^. L^-1 ANA for hypocotyls. The development of a protocol through indirect organogenesis of strawberries constitutes a valuable tool for future research.

Keywords: Callus; growth regulators; micropropagation; regeneration.

Recibido: 28-11-2025.

Aceptado: 02-06-2026.

La fresa (Fragaria x ananassa Duch.) es una especie cultivada de la familia Rosaceae con un fruto que tiene un significativo valor económico a nivel global (Li et al., 2025; Li et al., 2026), debido a su composición nutricional y ser fuente importante de folatos, vitamina C, fibra, potasio, flavonoides, antocianinas, antioxidantes y su distintivo sabor (Chung y Ouyang, 2021; Neri et al., 2022; Ramlal et al., 2025). En la última década, se ha observado un notable aumento en la producción de fresa, alcanzando un volumen total de 8,9 millones de toneladas durante el año 2020, siendo China el principal productor con una producción de 3,36 millones de toneladas (Arias et al., 2020; Food and Agriculture Organization-FAO, 2021; Li et al., 2026).

Debido a la importancia del cultivo, actualmente se hace necesaria la exploración de nuevos métodos tanto de propagación como de mejoramiento, con miras a la búsqueda de variedades con mejor calidad de fruta y capacidad de producción en gran volumen (García, 2022; Gupta, 2022). En ese sentido el uso de técnicas de micropropagación, particularmente aquellas enfocadas en organogénesis, pueden convertirse en alternativas prometedoras para la producción masiva de plantas de fresa de alta calidad, dado que poseen ciertas ventajas importantes como menor cantidad de material inicial, reducción del tiempo de proliferación, mayor control sanitario del material que se propaga y facilidad en el transporte (Chomboon & Lohasupthawee, 2022). El cultivo de tejidos ha permitido la multiplicación masiva en un tiempo corto de plantas in vitro, ya sea por regeneración directa o indirecta, y que tendrán un mayor rendimiento, vigor, resistencia a las plagas comparadas con las plantas propagadas convencionalmente (Banerjee et al., 2023).

La organogénesis es un proceso que implica en la formación de novo de órganos (raíces y/o brotes adventicios) a partir de explantes cultivados in vitro (Bidabadi & Jain, 2020). El tipo de explante y el tratamiento con reguladores de crecimiento han sido los principales factores que afectan la regeneración de la planta y, últimamente la eficiencia de la transformación genética (Akter et al., 2024; Kim et al., 2024; Lu et al., 2026). Para ello, se requirió el uso de nutrientes adecuados que favorecieron el creci-miento y la diferenciación de los tejidos, asimismo el medio de cultivo utilizado estuvo suplementado con fitorreguladores que favorecieron la regeneración de la planta (Long et al., 2022). Dentro de estos, los más utilizados incluyen a las auxinas (ácido indolbutírico – IBA, ácido indolacético - AIA, ácido naftalénacético - ANA), citoquininas (6-bencilaminopurina – BAP, acido 2,4 diclorofenoxiacético – 2,4-D), ácido giberé-lico (AG₃) y ácido absicico (ABA) (Agudelo et al., 2021). Previos estudios han explorado los distintos procesos incluidos en la organogénesis de fresa como la inducción de callos y la regeneración de brotes adventicios a partir de diferentes tipos de explantes, medios de cultivo, fitorreguladores y carbón activado, logrando resultados y protocolos eficaces (Hasan et al. 2010; Kim et al., 2024; Palei et al. 2017). El uso del Thidiazuron (TDZ) en el medio básico solo o en combinación con ANA o IBA fueron muy eficientes en la inducción de callos y regeneración de brotes (Li et al., 2026; Redhwan et al., 2026), y similar respuesta con el medio MS suplementado con BAP y Kinetina o 2,4-D (Aboksari et al., 2026; Sahu et al., 2026).

La optimización y ajuste de los protocolos de micropropagación a las condiciones específicas de cada laboratorio es un aspecto clave para garantizar el éxito del proceso. Debido a ello, la presente investigación tuvo como objetivo desarrollar y estandarizar un procedimiento de inducción de organogénesis indirecta a partir de dos tipos de explantes de fresa: hojas cotiledonares e hipocótilo.

Los explantes fueron sembrados en condiciones asépticas en placas de Petri conteniendo las diferentes combinaciones de medio de cultivo con reguladores de crecimiento. Posteriormente, las placas fueron selladas con parafilm y trasladadas al área de crecimiento en oscuridad para mantenerse en incubación durante 35 días con las condiciones de temperatura descritas previamente (García, 2022).

Regeneración de brotes

Seleccionado el mejor tratamiento de inducción de callos, según el análisis estadístico, se continuó con la inducción del proceso de regeneración y formación de brotes. Se utilizaron 36 explantes de hojas cotiledonares y 36 de hipocótilo. Para ello se utilizó el medio de cultivo MS complementado con distintos reguladores de crecimiento (Tabla 1) en tres combinaciones: T1) MS basal; T2) MS + 2,0 mg^.L^-1 BAP + 0,5 mg^.L^-1 TDZ+ 0,2 mg^.L^-1 2,4D, y T3) MS + 2,0 mg^.L^-1 BAP + 0,5 mg^.L^-1 TDZ+ 0,2 mg^.L^-1 ANA (García, 2022).

Al igual que en la inducción de callos, los explantes fueron sembrados en condiciones asépticas en placas de Petri con las diferentes combinaciones de medio de cultivo con reguladores de crecimiento y luego fueron selladas con parafilm y trasladadas al área de crecimiento en oscuridad para mantenerse en incubación durante 42 días con las condiciones de temperatura descritas previamente.

Enfoque y diseño experimental

El estudio se realizó siguiendo un enfoque cuantitativo experimental y fue subdividido en 3 etapas (desinfección, inducción de callos y regeneración) con el propósito de optimizar los procesos de manera independiente para lograr el objetivo general. En cada etapa se utilizaron dos tipos de explantes de fresa y a cada uno de ellos se le aplicaron 3 tratamientos con 3 repeticiones bajo un diseño factorial 2x3 completamente aleatorio.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos en porcentajes fueron convertidos previamente al arco seno raíz cuadrada del porcentaje. A estos datos transformados se les hizo un análisis de varianza (ANOVA) para evaluar el efecto de los tratamientos. Cuando se encontraron efectos significativos, se aplicó una prueba de comparación de medias de HSD Tukey con una probabilidad de error del 5%. (p ≤ 0,05). Para los análisis se empleó el programa R versión 4.0.2 (R Development Core Team, 2020).

Variables evaluadas

Se evaluaron las variables de contaminación, la tasa de inducción de callos y la tasa de regeneración de brotes. Para evaluar la contaminación se evaluó la efectividad de la desinfección efectuada contabilizan-do los explantes que se contaminaron y dividiendo entre el número total de explantes utilizados en la desinfección y se expresó este valor en porcentaje.

La tasa de eficiencia (%) de inducción de callos fue obtenida dividiendo el número de callos inducidos por el número total de explantes empleados y se expresó en porcentaje.

La tasa de eficiencia (%) de regeneración de brotes fue calculada dividiendo el número de brotes regenerados por el número total de los callos empleados para la regeneración y este valor se expresó en porcentaje.

Existió un efecto estadísticamente significativo de los tratamientos de reguladores de crecimiento sobre el porcentaje de inducción de callos con un valor de p= 1,22261E-07, efecto que se ratifica en la prueba de Tukey≤0,05. El tratamiento T3 con el medio MS suplementado con 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D y 1 mg^.L^-1 de TDZ indujo el porcentaje de callos más elevado seguido del tratamiento T2 con el medio MS adicio-nado con 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D y 0,1 mg^.L^-1 de BAP.

La interacción de los factores explantes y tratamientos mostró un efecto estadísticamente significativo con un valor de p=0,008955 en la prueba de ANOVA y que se reafirmó en la prueba de comparación de promedios de Tukey ≤0,05 (Figura 3), donde se visualiza que el tratamiento T3 con el medio MS suplementado con 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D y 1 mg^.L^-1 de TDZ, en ambos tipos de explantes, fue superior estadísticamente a los demás tratamientos en la inducción de callos. Cabe mencionar que cuando se utilizó solo medio basal (T1) no se observó la formación de callos en ninguno de los explantes.

Posterior a la introducción del explante a condiciones in vitro, la formación de callos es una etapa característica de la organogénesis indirecta (Martín et al., 2015). El uso del explante hojas cotiledonares (E1) obtuvo la mayor tasa de inducción de callos con 44,44±4,32% superando estadísticamente al tipo de explante hipocótilo. Otros investigadores han reportado hasta una tasa de eficiencia de 90% en inducción de callos con el uso de tiras de hojas como explante (Akter et al., 2024). Los resultados señalaron que, durante esta etapa, no se observó la formación de masas celulares indiferenciadas cuando se utilizó solo medio de cultivo basal, lo cual pone de manifiesto la necesidad del uso de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo para la estimulación de callos (Córdova et al., 2014; García, 2022). Los reguladores de crecimiento relacionados con este proceso son las auxinas y citoquininas, cuya combinación y concentración dentro del medio de cultivo resulta clave (Alcántara et al., 2019). Mientras que las auxinas inducen el crecimiento celular al inducir la expresión de genes relacionados con el aumento de la plasticidad y ablandamiento de la pared celular (Córdova et al., 2014), las citoquininas afectan directamente la división celular al estar relacionadas con la regulación del ciclo celular, la formación de brotes y el retraso de la senescencia (George et al., 2007).

Los resultados señalaron que los tratamientos compuestos por medio MS complementado con 0,2 mg^.L^-1 2,4D y 1,0 mg^.L^-1 TDZ produjeron mayores porcentajes de inducción de callos en ambos explantes (91,67±3,02% en hojas cotiledonares y 50,00±0,00 % en hipocótilo) por lo que se puede afirmar que la mejor respuesta en la inducción de callos se obtuvo cuando se aplicó una concentración menor de auxina y mayor de citoquinina (Hernández et al., 2025). Resultados exitosos de porcentajes de inducción de callos cercano a 100% usando las mismas combinaciones de reguladores han sido previamente reportados en fresas de variedad Calypso (Cappelletti et al., 2016). Similares respuestas en la inducción de callos se han reportado utilizando la combinación de 2,4D y TDZ (97,3%) (Chung y Ouyang, 2021; Redhwan et al., 2026). Akter et al. (2024) reportaron 90% de inducción de callos usando tiras de hojas y con la combinación de reguladores de crecimiento 0,5 mg^. L^-1 de 6-benzylaminopurina y 1,0 mg^. L^-1 de ácido naftalen-acético. Se han reportado resultados de hasta 100% de inducción de callos en hipocótilos y cotiledones de la especie Physalis peruviana con el uso de 0,5 - 0,25 mg^. L^-1 de 2,4-D más 0,1 - 1 mg^. L^-1 de BAP, respec-tivamente (Hernández & Chico, 2020). En espacies ornamentales como la azucena y el lirio se reportaron para la inducción de callos, tasas de 77,78% y 85,00% (Aboksari et al., 2026; Lu et al., 2026).

Regeneración de brotes

La prueba de ANOVA para esta característica determinó que no hubo significación estadística para el factor explantes al presentar un valor de p=0,410467 lo que se confirmó al realizar la comparación de promedios de Tukey ≤0,05.

Se presentó un efecto estadísticamente significativo de los tratamientos de reguladores de crecimiento sobre la regeneración de brotes con un valor de p=0,006835. En la Tabla 4 se visualiza que el tratamiento T3 compuesto por el medio MS adicionado con 2 mg^.L^-1 de BAP, 0,5 mg^.L^-1 de TDZ y 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D presentó el mayor porcentaje de regeneración de brotes y superó estadísticamente al tratamiento T1 que solo utilizó el medio basal.

Para el caso de la interacción (p=0,004489), en los explantes de las hojas cotiledonares (Figura 4), el tratamiento T2 compuesto por el medio MS adicionado con 2 mg^.L^-1 de BAP, 0,5 mg^.L^-1 de TDZ y 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D presentó el mayor porcentaje de regeneración. Contrariamente, al utilizar como explante el hipocótilo se observó que el tratamiento T3 compuesto por el medio MS suplementado con 2 mg^.L^-1 de BAP, 0,5 mg^.L^-1 de TDZ y 0,2 mg^.L^-1 de ANA mostró el porcentaje de regeneración más elevado, comparado al tratamiento T2 (medio MS con 2 mg^.L^-1 de BAP, 0,5 mg^.L^-1 de TDZ y 0,2 mg^.L^-1 de 2,4 D) y el tratamiento T1 compuesto por el medio basal MS que solo alcanzaron un 8,33±3,02% de regeneración de brotes.

Al igual que en la etapa anterior, las auxinas y las citoquininas también juegan un papel importante en la regeneración de brotes, siendo ésta a partir de la cual se considera concluido y exitoso el proceso de organogénesis (George et al., 2007; Jhajhra et al., 2018). En el caso de las hojas cotiledonares, el porcentaje más alto de regeneración de brotes (50,00±2,27%) se obtuvo con el tratamiento T2 compuesto por el medio MS suplementado con 2,0 mg^.L^-1 BAP; 0,5 mg^.L^-1 TDZ y 0,2 mg^.L^-1 2,4D que resultaron casi similares a la más alta tasa de inducción de brotes (56,6%) obtenidos con el uso de tiras de hojas (Akter et al., 2024). Estos resultados fueron inferiores a los obtenidos utilizando medio suplementado con IBA 3,0 mg^.L^-1 y BAP 0,2 mg^.L^-1 en fresas de variedad Sveva (Cappelletti et al., 2016). Por su parte, en la regeneración de brotes a partir de hipocótilo, el mayor el porcentaje (75,00±5,24%) se consiguió con el tratamiento T3 compuesto por el medio MS adicionado con 2,0 mg^.L^-1 de BAP; 0,5 mg^.L^-1 TDZ y 0,2 mg^.L^-1 de ANA. Karmaker et al. (2023) reportaron para diferentes cultivares de fresa, el uso de 1,5 mg^.L^-1 BA+0,5 mg^.L^-1 GA₃ que alcanzó entre 85 a 95% de regeneración de brotes.Otros investiga-dores han reportado hasta 100,00% de regeneración de brotes a los 42 días con el uso de 3 mg^.L^-1 de TDZ más 0,2 mg^. L^-1 de IBA (Li et al., 2026). En la organogénesis directa para la fresa cv Chandler se ha reportado hasta 89,8% de regeneración de brotes (Palei et al., 2025). De manera general, estos resultados corroboran que las bajas concentraciones de auxinas con altas concentraciones de citoquininas, en el caso de distintos tipos de explantes, promueven la formación de regenerantes (Naing et al., 2019; García, 2022; Hernández et al., 2025). La diferencia entre los tratamientos para la regeneración de callos en hojas cotiledonares e hipocótilos, puede estar fundamentada en las distintas respuestas que poseen los explantes de las especies vegetales ante las auxinas y citoquininas presentes en el medio de cultivo (Hernández & Chico, 2020). Estas respuestas pueden deberse a variaciones en el contenido endógeno de las hormonas en los explantes y a sus características anatómicas (Espinosa et al., 2012). Por su parte, la afinidad expresada por los diferentes explantes, donde se observa que el mejor tratamiento para la regeneración a partir de hojas cotiledonares se da con el uso de 2,4D, mientras que el mejor tratamiento para la regeneración de hipocótilo se da con el uso ANA, puede ser explicada por la expresión diferencial de receptores de auxina en distintas partes de la planta (Lin et al., 2013).

Tabla 5

Tasas de inducción de callos y regeneración de brotes de la investigación y de otros investigadores

ESPECIE	METODOLOGÍA	INDUCCIÓN CALLOS (%)	REGENERACIÓN BROTES (%)	REFERENCIA
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	50,00-91,67	50,00-75,00	(1)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	61,90-68,60	100,00	(Li et al., 2026)
Fragaria x ananassa	Organogénesis directa	-	68,30	(Hernández et al., 2025)
Fragaria x ananassa	Organogénesis directa	-	89,80	(Palei et al., 2025)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	90,00	56,60	(Akter et al., 2024)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	80,30	42,80-70,70	(Kim et al., 2024)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	-	85,00-95,00	(Karmaker et al., 2023)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	-	98,00	(Nalini et al., 2021)
Fragaria x ananassa	Organogénesis Indirecta	-	83,00-90,00	(Naing et al., 2019)
Fritillaria pontica	Organogénesis Indirecta	100,00	66,70	(Redhwan et al., 2026)
Solanum tuberosum	Organogénesis Indirecta	100,00	Gran regeneración	(Sahu et al., 2026)
Plantago ovata	Organogénesis Indirecta	62,00	Gran regeneración	(Sharma et al., 2026)
Zantedeschia spp	Organogénesis Indirecta	85,00	88,00	(Aboksari et al., 2026)
Lilium longiflorum	Organogénesis Indirecta	77,78	68,00-71,11	(Lu et al., 2026)
Acer truncatum	Organogénesis Indirecta	97,17	10,51	(Du et al., 2026)
Nardostachys jatamansi	Organogénesis Indirecta	93,33	68,00	(Joshi et al., 2026)
Physalis peruviana	Organogénesis Indirecta	50,00-100,00	20,00	(Hernández & Chico, 2020)

(1) Datos que corresponden a la Investigación.

CONCLUSIONES

Aboksari, H. A., Zeinalabedini, M., Nalousi, A. M., Hashemidehkordi, E., & Azadi, P. (2026). Micropropagation and flowering of calla Lily via proliferative basal cluster enhancement by fipexide. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 164, 69. https://doi.org/10.1007/s11240-026-03372-8

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Clase de Regulador de crecimiento	Nombre del regulador de crecimiento	Abreviación	Concentración
Auxinas	Ácido Naftalenacético	ANA	1 mg^. ml^-1
Auxinas	Ácido Diclorofenoxiacetico	2,4-D	1 mg^. ml^-1
Citoquininas	Bencilaminopurina	BAP	1 mg^. ml^-1
Citoquininas	Thidiazuron	TDZ	1 mg^. ml^-1

Explantes	Contaminación (%)	Efectividad (%)	Tratamientos	Contaminación (%)	Efectividad (%)
E1	33,33±2,91 a	66,67	T1	70,83±3,90 b	29,17
E2	58,33±3,41 a	41,67	T2	54,17±2,57 b	45,83
			T3	12,50±2,00 a	87,50

Explantes	Inducción de callos (%)	Tratamientos	Inducción de callos (%)
E1	44,44±4,32 a	T1	0,00±0,00 c
E2	27,78±1,47 b	T2	37,50±0,34 b
		T3	70,83±2,45 a

Explantes	Regeneración de brotes (%)	Tratamientos	Regeneración de brotes (%)
E1	22,22±1,72 a	T1	4,17±0,76 b
E2	30,55±3,47 a	T2	29,17±2,90 ab
		T3	45,83±4,68 a