PCR-RFLP In silico del gen 18S rRNA como alternativa para la identificación de nematodos entomopatógenos

 

In silico PCR-RFLP of the 18S rRNA gene as an alternative for the identification of entomopathogenic nematodes

 

Archi Alejandro Ruiz-Polo1 ; Joel Michel Riojas-Gonzales2, 3; Pedro S. Castillo-Carrillo2;

César Augusto Mogollón-Farias2, 3; Milton Valladolid-Ramos2;  Segundo Melecio Garcia-Garcia2, 3;

Rosa Esmelda Cornejo-Hidalgo2; Cesar Alejandro Vasquez-Garcia3; Jose Stalyn Cordova Campos1, 2

 

1  Estación Experimental Agraria Los Cedros. Dirección de Recursos Genéticos y Biotecnología. Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Panamericana Norte kilómetro 12, Tumbes, Perú.

2  Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Tumbes. Ciudad Universitaria, Av. Universitaria S/N, Tumbes, Perú.

3  Estación Experimental Agraria Los Cedros. Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Tumbes. Perú.

 

* Autor corresponsal: archi.ruiz.polo.mail.work@gmail.com (A. A. Ruiz-Polo).

 

ORCID de los autores

 

A. A. Ruiz-Polo: https://orcid.org/0009-0005-1273-2625                               S. M.  Garcia-Garcia: https://orcid.org/0009-0003-6300-9221

J. M. Michel Riojas-Gonzales: https://orcid.org/0009-0007-9966-9554      R. E. Cornejo-Hidalgo: https://orcid.org/0000-0002-2010-0442

P. S. Castillo-Carrillo: https://orcid.org/0000-0002-0255-1047                     C. A. Vasquez-García: https://orcid.org/0009-0005-2803-7264

C. A. Mogollón-Farias: https://orcid.org/0009-0000-5390-9208                    J. S. Cordova-Campos: https://orcid.org/0000-0002-5891-4679

M. Valladolid-Ramos: https://orcid.org/0000-0002-0526-0544

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RESUMEN

 

En países en vías de desarrollo, el acceso a tecnologías modernas para el control de plagas es restringido, lo que plantea la necesidad de innovar en métodos y/o técnicas alternativas que sean más accesibles. El objetivo del estudio fue determinar la PCR-RFLP in silico del gen 18S ARNr como técnica alternativa en la identificación de nemátodos entomopatógenos. Se evaluaron dos cepas purificadas de larvas adultas de nematodos entomopatógenos, a partir de las cuales se extrajo el ADN genómico. Posteriormente, se llevó a cabo la amplificación del gen 18S del ARNr mediante PCR convencional y una secuenciación de ADN por la tecnología de Sanger en doble cadena. Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el software MEGA v.11 y se generaron secuencias consenso de aproximadamente 850 pares de bases. Luego, se utilizaron herramientas como BLAST para la asignación taxonómica de especies y Restriction Mapper v.3 para el análisis de sitios de restricción y simulación de digestión enzimática. Las cepas analizadas se identificaron como Heterorhabditis indica y Heterorhabditis bacteriophora. En Heterorhabditis indica se hallaron 26 sitios de restricción, seleccionando cuatro sitios según su posición media (MslI, NruI, Tsp45I y BseRI), que luego de digerirlos in silico, generaron fragmentos de ADN con longitudes distintas. Por otra parte, en Heterorhabditis bacteriophora, se halló el mismo número de sitios de restricción, se seleccionaron tres (BglII, FokI y BstXI) y al digerirlos se obtuvieron fragmentos de ADN con diferentes longitudes. Los fragmentos de ADN (RFLP) obtenidos permitieron diferenciar claramente ambas especies. Los resultados demuestran que la técnica PCR-RFLP In silico del gen 18S ARNr es una herramienta efectiva para la identificación taxonómica de nematodos entomopatógenos, ofreciendo una alternativa viable en contextos donde los recursos son limitados y el control biológico es una alternativa.

 

Palabras clave: Entomología; Material genético; Plaga; PCR; RFLP.

 

ABSTRACT

 

In developing countries, access to modern pest control technologies is limited, highlighting the need to innovate in alternative methods and/or techniques that are more accessible. The aim of this study was to determine the in silico PCR-RFLP of the 18S rRNA gene as an alternative technique for the identification of entomopathogenic nematodes. Two purified strains from adult larvae of entomopathogenic nematodes were evaluated, from which genomic DNA was extracted. Subsequently, the 18S rRNA gene was amplified using conventional PCR, followed by double-stranded DNA sequencing via Sanger technology. The obtained sequences were aligned using MEGA v.11 software, and consensus sequences of approximately 850 base pairs were generated. Tools such as BLAST were then used for taxonomic species assignment, and Restriction Mapper v.3 was used for restriction site analysis and in silico enzymatic digestion simulation. The analyzed strains were identified as Heterorhabditis indica and Heterorhabditis bacteriophora. In Heterorhabditis indica, 26 restriction sites were found, with four selected based on their average position (MslI, NruI, Tsp45I, and BseRI), which, after in silico digestion, generated DNA fragments of different lengths. On the other hand, in Heterorhabditis bacteriophora, the same number of restriction sites was found, with three selected (BglII, FokI, and BstXI), and digestion also produced DNA fragments of varying lengths. The obtained DNA fragments (RFLPs) allowed for clear differentiation between the two species. The results demonstrate that the In silico PCR-RFLP technique of the 18S rRNA gene is an effective tool for the taxonomic identification of entomopathogenic nematodes, offering a viable alternative in contexts where resources are limited and biological control is a viable option.

 

Keywords: Entomology; Genetic material; Pest; PCR; RFLP.

 

 

Recibido: 05-08-2025.    

Aceptado: 27-03-2026.

Esta obra está publicada bajo la licencia CC BY 4.0

INTRODUCCIÓN

 

Los nematodos entomopatógenos han adquirido una notable relevancia en el ámbito del control biológico de plagas, debido a su capacidad de actuar como agentes letales contra insectos que afectan negativamente la productividad agrícola (Půža & Tarasco, 2023). Estos organismos establecen asociaciones simbióticas con bacterias de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus, las cuales son liberadas en el interior del hospedero tras la infección, provocando septicemia y la muerte del insecto en un corto periodo de tiempo (Gaugler, 2002). Esta característica los posiciona como herramientas prometedoras dentro de programas de manejo integrado de plagas, especialmente en sistemas agrícolas sostenibles (Koppenhöfer et al., 2020; Nurashikin-Khairuddin, et al., 2022).

Entre los principales nematodos entomopatógenos destacan especies de los géneros Heterorhabditis y Steinernema, ampliamente estudiadas por su eficacia biocontroladora (Yangüéz et al., 2024). Dentro de estas, Heterorhabditis indica (Shinde et al., 2022) y Heterorhabditis bacteriophora (Sánchez et al., 2019; Leonar et al., 2022) han demostrado alta virulencia frente a diversos insectos plaga. Asimismo, especies como Steinernema riobrave y Rhabditis blumi han sido reportadas como parásitos obligados, cuya fase infectiva juvenil penetra al hospedero a través de aberturas naturales, facilitando la colonización interna y posterior reproducción en el cadáver del insecto (Poinar, 1979; Gaugler, 2002).

La correcta identificación de estas especies resulta crucial, ya que su eficacia en el control biológico depende de factores como la especificidad del hospedero, condiciones ambientales y características genéticas propias de cada cepa (Rusinque et al., 2023; Rangarajan et al., 2025). Tradicionalmente, la identificación de nematodos se ha basado en características morfológicas; sin embargo, estas presentan limitaciones debido a la plasticidad fenotípica y similitudes entre especies (Bogale et al., 2020; Bhat et al., 2022). En respuesta a estas limitaciones, se han desarrollado enfoques moleculares basados en la amplificación y secuenciación de marcadores genéticos, como el gen 18S ARNr, ITS y COI, los cuales permiten una identificación más precisa (Valderrama-Aravena, 2025).

No obstante, técnicas como la secuenciación de ADN y la espectrometría de masas, aunque altamente precisas, implican elevados costos, requerimientos tecnológicos especializados y limitada accesibilidad en países en vías de desarrollo (Córdova-Campos et al., 2023). Esta situación restringe su aplicación en contextos donde el control biológico podría tener mayor impacto, generando la necesidad de alternativas metodológicas más accesibles, sin comprometer la confiabilidad en la identificación taxonómica.

En este contexto, la técnica de PCR-RFLP (Reacción en Cadena de la Polimerasa seguida de Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción) se presenta como una herramienta eficiente, rápida y de bajo costo para la diferenciación de especies mediante el análisis de patrones de restricción del ADN (Chena et al., 2014; Torchia et al., 2021; Gao et al., 2023). Diversos estudios han demostrado su aplicabilidad en la identificación de organismos en distintos grupos biológicos, incluyendo nematodos, destacando su utilidad en entornos con recursos limitados (Peraza-Padilla et al., 2013; Montero et al., 2007; Madikadike et al., 2024). Asimismo, investigaciones recientes han señalado que, la PCR-RFLP posee un potencial alto para discriminar especies cercanas mediante el análisis de regiones conservadas en marcadores ribosomales (Niloufar, 2020).

A pesar de estos avances, existe un vacío en el conocimiento respecto a la validación sistemática de la técnica PCR-RFLP mediante enfoques in silico aplicados específicamente a nematodos entomopatógenos. En particular, son limitados los estudios que evalúan la capacidad discriminatoria de enzimas de restricción sobre secuencias del gen 18S ARNr en diferentes especies, lo que dificulta establecer protocolos estandarizados y reproducibles para su implementación en programas de control biológico.

En ese sentido, estudios bioinformáticos orientados a evaluar la viabilidad de la PCR-RFLP in silico resultan fundamentales, ya que permiten predecir patrones de restricción, optimizar la selección de enzimas y reducir costos experimentales. Además, su aplicación contribuiría al fortalecimiento de estrategias de manejo agroecológico, mediante la caracterización precisa y oportuna de nematodos entomopatógenos tanto autóctonos como introducidos.

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la viabilidad de la técnica PCR-RFLP in silico del gen 18S ARNr como alternativa para la identificación de nematodos entomopatógenos.


 

 

METODOLOGÍA

 

Diseño del estudio

Se desarrolló una investigación compuesta por una fase in vitro y otra in silico, bajo un diseño no experimental, con enfoque cualitativo y nivel descriptivo. El estudio se basó en el análisis de bioinformática de las secuencias del ADN del gen ribosomal 18S de dos especímenes de nematodos entomopatógenos aislados en el norte de Perú. El diseño de la investigación y su flujo de trabajo se observa en la Figura 1, la cual describe en la metodología cada uno de los componentes.

 

Figura 1. Esquema del diseño de la investigación In silico en la que se describe el flujo de trabajo desde el organismo vivo (nematodo) hasta la fragmentación del gen 18S ARNr mediante análisis bioinformáticos.

 

Material biológico

Dos cepas (H1 y H2) de larvas adultas de nematodos pertenecientes al género Heterorhabditis, purificadas y previamente enfrentadas al insecto plaga Galleria mellonella (polilla de cera), fueron proporcionadas por la Universidad Nacional de Tumbes. Las cepas corresponden a aislados de suelos asociados a Neltuma pallida, recolectadas en la región de Tumbes, Perú (3°34'1'' S, 80°27.092' O).

 

Extracción de ADN y PCR dirigida al gen 18S ARNr

Las cepas purificadas contenidas en una solución de suspensión, fueron sometidas a un protocolo de extracción de ADN genómico siguiendo las instrucciones del método estándar de un kit comercial. Luego, el gen 18S ARNr fue amplificado utilizando los cebadores SSU18A: AAAGATTAAGCCATGCATG y SSU26R: CATTCTTGGCAAATGCTTTCG. La reacción de PCR se preparó en un volumen total de 25 µL, compuesto por 15,4 µL de agua ultra pura, 2,5 µL de tampón 10X, 1,5 µL de MgCl₂ (25 mM), 0,5 µL de mezcla de dNTPs, 0,5 µL de cada cebador, 0,1 µL de Taq ADN polimerasa y 4 µL de ADN genómico.

El programa de amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos con desnaturalización a 94 °C por 1 minuto, alineamiento a 52 °C por 1 minuto y 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 2 minutos. Finalmente, se realizó una extensión final a 68 °C por 10 minutos y conservación a 4 °C por un máximo de 24 horas. Se incluyó un control negativo para descartar contaminación durante la amplificación, como producto PCR se esperó un amplicón con un tamaño de 850 pares de bases (pb).

 

Electroforesis en gel de agarosa

Los productos de PCR fueron evaluados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %, preparado en solución tampón TAE 1X y teñido con bromuro de etidio a una concentración de 0,5 ng/mL. Para cada corrida se emplearon 8 µL del amplicón, 4 µL de tampón de carga y 2 µL de un marcador de peso molecular de 1000 pares de bases. La separación electroforética se realizó aplicando un voltaje de 70 V durante 30 min.

 

Secuenciación de ADN

Los productos amplificados por PCR fueron enviados a una empresa especializada en servicios biotecnológicos para su secuenciación mediante la tecnología Sanger de doble cadena. Las secuencias obtenidas fueron entregadas en formato FASTA, un archivo de texto plano estandarizado, utilizado para su posterior análisis de bioinformática. Posteriormente, las secuencias se analizaron mediante softwares de bioinformática.

 

Asignación taxonómica

Se realizó un alineamiento de secuencias de ADN utilizando el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), versión 11. Las secuencias obtenidas de las lecturas directa (SSU18A) e inversa (SSU26R) fueron alineadas por complementariedad de bases, empleando el algoritmo MUSCLE.

Posteriormente, se depuraron los extremos no coincidentes, huecos y se seleccionó la región consenso, la cual fue exportada en formato FASTA a la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST, por sus siglas en inglés), con la que se realizó la asignación taxonómica de las secuencias de ADN a nivel de especie, mediante comparación de similitudes con secuencias disponibles en el banco de genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés). Los parámetros de homología considerados fueron una cobertura y similitud mínima del 95% y máxima del 100%. Finalmente, las secuencias fueron conservadas en formato FASTA para la identificación de sitios de restricción.

 

Mapeo de sitios de restricción

Se realizó un mapeo de sitios de restricción coincidentes con endonucleasas homónimas en las secuencias del presente estudio y en las secuencias con las que se halló similitud. El mapeo se realizó empleando el software Restriction Mapper, versión 3. Los parámetros considerados fueron: confor-mación lineal del ADN, ordenamiento de enzimas por frecuencia de corte, filtrado limitado a un máximo de un sitio de corte, longitud mínima del sitio de reconocimiento de cinco pares de bases, inclusión de todas las enzimas comerciales y consideración de extremos cohesivos y extremos romos (-5’-3’-). Como producto, se obtuvo un mapa detallado de sitios de restricción.

 

Digestión enzimática In silico

La digestión enzimática fue simulada en software Restriction Mapper, v. 3. Previamente, se seleccionó un sitio de restricción ubicado aproximadamente en la región media de la secuencia consenso del gen, con el objetivo de generar fragmentos de ADN de tamaño representativo y fácilmente observables en aplica-ciones in vitro. Se fragmentó la secuencia total del gen en los sitios de restricción seleccionados y se obtuvieron fragmentos de longitud polimórfica (RFLP) con distintos tamaños según la posición de los sitios.

 

Aspectos éticos

Se utilizaron especímenes de nematodos prove-nientes de una tesis de la Universidad Nacional de Tumbes, adoptando consideraciones éticas, como la gestión de permisos y la mención del origen del material biológico analizado.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

Asignación taxonómica


Los productos amplificados por PCR del gen 18S ARNr fueron secuenciados y alineados, lo que permitió la construcción de secuencias consenso de 850 pares de bases tanto para el nematodo H1 como para H2. Estas secuencias fueron posterior-mente analizadas mediante la herramienta BLAST, donde se compararon con secuencias homólogas disponibles en la base de datos del NCBI. El análisis de similitud reveló una correspondencia taxonó-mica difusa, ya que a H1 y H2 se asignaron especies que no corresponden al género Heterorhabditis, tal como estaban previamente identificadas mediante taxonomía clásica.

No obstante, entre las otras especies asignadas, se observaron especies del género Heterorhabditis, por lo que se seleccionaron aquellas que poseen una cobertura y similitud máxima del 99%. Se tamizaron las similitudes con especies distintas a Heterorhabditis. Se seleccionaron las especies Heterorhabditis indica para H1 y Heterorhabditis bacteriophora para H2 (Tabla 1). Los resultados de la asignación taxonómica son consistentes con lo reportado por Córdova-Campos et al. (2025), quienes, mediante el análisis molecular del gen 18S ARNr, lograron identificar cepas de nematodos aisladas de suelos forestales. En dicho estudio, estas cepas fueron evaluadas frente a larvas de Galleria mellonella, determinándose qué las especies con efecto nematicida fueron Hetero-rhabditis indica y Heterorhabditis bacteriophora. Por otro lado, diversos autores han destacado la alta sensibilidad del gen 18S ARNr como marcador molecular en la identificación precisa de nemato-dos (Floyd et al., 2002; Vera-Morales et al., 2024), también señalado en estudios realizados en Perú (Córdova-Campos et al., 2023),

De acuerdo con Vélez & Guzmán (2022), además de los genes 18S del ADN ribosómico (ADNr), otras regiones genéticas comúnmente utilizadas para la identificación de nematodos de importancia agrícola incluyen secuencias del ADN mitocondrial (mtDNA) y regiones del espaciador intergénico (IGS), lo que permite una caracterización molecular más completa y precisa. Por su parte Chaves-Velásquez et al. (2023) destacan que tanto el gen 18S del ADN ribosómico como la región interna transcrita que abarca ITS1-5.8S-ITS2 constituyen herramientas moleculares eficaces para la identificación específica de nematodos fitopará-sitos asociados a cultivos de interés agrícola como el plátano y el banano.


 

Tabla 1

Determinación taxonómica de nematodos a nivel especie mediante análisis de similitud de secuencias de ADN del gen 18S ARNr

 

Cepa

Especie

% Cobertura

% Identidad

Nº Accesión

H1

Heterorhabditis indica

99

99,65

PQ608564.1

Heterorhabditis indica

97

99,52

OL470132.1

Heterorhabditis indica

97

99,28

OK562793.1

 

H2

Heterorhabditis bacteriophora

95

100

JN996479.1

Heterorhabditis bacteriophora

95

99,87

JN996475.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,54

AF036593.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,54

FJ040428.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,54

FJ040429.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,54

OR999415.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,42

FJ040430.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,42

KJ636408.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,42

KY299838.1

Heterorhabditis bacteriophora

97

97,42

MK214461.1

En conjunto, estos hallazgos refuerzan la utilidad del gen 18S ARNr como herramienta confiable en estudios de sistemática molecular de nematodos entomopatógenos u otras especies como fitoparásitos.

 

Mapeo de sitios de restricción

Se identificaron diversos sitios de restricción a lo largo de la secuencia del gen 18S ARNr en las especies de nematodos analizadas. En Heterorhabditis indica se detectaron 30 sitios, de los cuales 26 se preseleccionaron, y posterior-mente se eligieron 3 (resaltados en amarillo) en función de su ubicación en posiciones cercanas a la región media de la longitud total de la secuencia, esto con el fin de que cuando la técnica se reproduzca In vitro, los RFLPs puedan ser visualizados como bandas con luminiscencia nítida en los geles de agarosa (Tabla 1).

De forma análoga, se identificaron 58 sitios de restricción en Heterorhabditis bacteriophora, de los cuales también se preseleccionaron 26, seleccio-nando finalmente 3 sitios (resaltados en verde) aplicando el mismo criterio de la posición media en la secuencia del gen (Tabla 2).

Según Inglehart & Nelson (1994), desde hace décadas los mapeos de sitios de restricción automatizados poseen limitaciones, puesto que al evaluarse 8 programas de mapeo, desarrollados hasta 1993, se evidenció la falta de distinción y fiabilidad de mapas verdaderos dado la manifes-tación de errores en la búsqueda de sitios de restricción. Sin embargo, estudios realizados durante los mismos años en Japón, han evidenciado que, la PCR-RFLP empleada con genes mitocon-driales puede ser eficiente, puesto que se ha permitido la identificación molecular precisa de las especies de nematodos M. hapla, M. suginamiensis, M. marylandi, M. mali, M. camelliae, M. sp. near mali y M. sp. near arenaria (Orui, 1998). Posteriormente, se demostró la existencia de mejoras sustanciales en la aplicación de esta técnica, por ejemplo, Solano et al. (2011), evidenciaron una alta precisión de sitios de restricción mapeados mediante el uso de enzimas específicas como Dra I y Hinf I, las cuales permitieron diferenciar especies de nematodos agalladores del género Meloidogyne asociados a plantas ornamentales, a partir de productos de PCR del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa Subunidad I (COI). No obstante, actualmente en países como Estados Unidos, técnicas como la PCR convencional, aún sigue considerándose para la identificación del nemátodo agallador Meloidogyne spp, siendo el ADN mitocondrial y ribosomal las dianas moleculares empleadas (Ye et al., 2019; Ye et al., 2021).

 

Digestión enzimática in silico

La digestión enzimática in silico del gen 18S ARNr de Heterorhabditis indica, utilizando los sitios de restricción MslI, NruI, Tsp45I y BseRI, generó fragmentos de ADN de diferentes longitudes (Figura 2). De manera similar, la digestión computacional del gen 18S ARNr de Heterorhabditis bacteriophora con las endonucleasas de restricción BglII, FokI y BstXI produjo fragmentos de ADN con tamaños variables (Figura 3).


 

Tabla 2

Sitios de restricción en el gen ribosomal 18S de los nematodos entomopatógenos analizados

 

Nº

Heterorhabditis indica

 

Heterorhabditis bacteriophora

Enzima

Secuencia

Posición de corte

 

Enzima 

Secuencia

Posición de corte

1

HpaI

GTTAAC

794

 

AccI       

   GTMKAC               

267

2

MslI

CAYNNNNRTG            

443

 

ApoI      

    RAATTY               

821

3

NruI

      TCGCGA                  

338

 

AvaII     

    GGWCC                 

829

4

PsiI

      TTATAA                 

33

 

BccI       

     CCATC                  

245

5

AccI

GTMKAC

178

 

BglII      

    AGATCT               

443

6

AvrII

     CCTAGG                   

615

 

FokI       

         GGATG

326

7

BccI

      CCATC 

250

 

NcoI      

     CCATGG               

271

8

BclI

    TGATCA

282

 

SfaNI     

          GCATC             

118

9

BsmAI

     GTCTC 

408

 

SmlI       

         CTYRAG

223

10

FauI

     CCCGC  

654

 

TfiI        

      GAWTC               

579

11

MluI

    ACGCGT

287

 

VspI       

      ATTAAT             

768

12

NcoI

    CCATGG

276

 

XhoI       

     CTCGAG               

223

13

SalI

    GTCGAC

177

 

BciVI     

      GTATCC              

812

14

Tsp45I

     GTSAC  

398

 

BseMII  

       CTCAG                

577

15

Tth111I

 GACNNNGTC              

586

 

BsgI       

      GTGCAG             

156

16

XbaI

    TCTAGA

90

 

BsrDI    

      GCAATG             

530

17

BseRI

    GAGGAG                   

405

 

BstXI     

  CCANNNNNTGG

419

18

BsmI

    GAATGC                   

812

 

EciI        

        GGCGGA

202

19

NspI

    RCATGY

106

 

Eco57I  

     CTGAAG              

630

20

SacII

    CCGCGG

509

 

GsuI       

CTGGAG   

115

21

AflIII

    ACRYGT

222, 287

 

HaeIV    

GAYNNNNNRTC

468

22

ApoI

    RAATTY                   

836

 

MboII    

GAAGA

449

23

AvaII

    GGWCC 

588, 756

 

MmeI    

TCCRAC    

537

24

EcoP15I

    CAGCAG

388, 530

 

NmeAII 

GCCGAG

617

25

PleI

     GAGTC 

174, 305

 

NspI      

RCATGY    

109

26

StyI

   CCWWGG                  

276, 615

 

SacII      

CCGCGG    

500

n/r: “no registra”.


 

Figura 2. PCR-RFLP in silico del gen 18S ARNr de Heterorhabditis indica.

 

Los resultados demostraron qué, mediante los sitios de restricción seleccionados se obtienen RFLPs con tamaños suficientes como para ser visualizados en geles de agarosa in vitro, lo cual hace posible diferenciar ambas especies previamente asignadas por taxonomía molecular. Perteguer et al. (2004) aplicaron un enfoque similar para la caracterización de nematodos anisákidos provenientes de peces, utilizando regiones amplificadas del ITS-1, el gen del ARN ribosomal 5.8S, el ITS-2 y una porción del gen 28S, revelando que la digestión enzimática dirigida a sitios de restricción permitió no solo identificar la especie, sino también evidenciar la existencia de variabilidad genética intraespecífica. Otros autores como Rodríguez (2019), han identificado a Heterorhabditis bacteriophora y Heterorhabditis indica mediante la digestión enzimática del sitio de restricción Alu1 del gen 28S ARNr demostrando que dichas regiones de ADN permiten una identificación específica de nematodos.

A lo largo de los últimos años, se ha evidenciado un incremento sostenido en el uso de softwares especializados para el mapeo in silico de sitios de restricción, los cuales se han consolidado como herramientas fundamentales en diversas disciplinas (Bikandi et al., 2004; Laref et al., 2024). Estas plataformas permiten optimizar la precisión en la identificación y localización de sitios de corte a lo largo de secuencias genómicas completas (Ruiz-Polo, Luis Arismendiz et al., 2024; Chena et al., 2014), facilitando la generación de perfiles RFLP cuyas longitudes teóricas predichas muestran una alta concordancia con los patrones obtenidos experimentalmente en laboratorio (Wang et al., 2025; Ruiz-Polo, Santillán-Valdivia et al., 2024).

 

 

Figura 3. PCR-RFLP in silico del gen 18S ARNr de Heterorhabditis bacteriophora.



Tabla 3

Comparación entre las características de técnicas moleculares empleadas para la identificación de nematodos

 

 

Técnica molecular

Características

Tiempo en la obtención de resultados

Complejidad de uso

Especificidad/

sensibilidad

 

Fuente

 

PCR convencional

2 a 3 horas

Requiere capacitación técnica especializada para el manejo de equipos y reactivos de extracción de ADN y amplificación de genes

Sensibilidad: Moderada

Especificidad: Moderada (depende de los primers)

Floyd et al. (2005)

Carta & Li (2018)

Rodríguez (2019)

Huang et al. (2023)

 

qPCR

2 a 4 horas

 

Requiere capacitación técnica especializada para el manejo de equipos y reactivos de secuenciación

Sensibilidad:

Muy alta

Especificidad: Muy alta

Huang et al. (2007)

Chen et al. (2022)

Hodson et al. (2023)

Huang et al. (2023)

Goraya y Yan. (2024)

Córdoba-Sánchez et al. (2026)

 

PCR multiplex

2 a 4 horas

Requiere capacitación técnica especializada para el manejo de equipos y reactivos de secuenciación

Sensibilidad: Moderada a alta

Especificidad:

Alta (si está bien optimizada)

Fang et al. (2010)

Hu et al. (2011)

Huang et al. (2019)

Ren et al. (2024)

 

PCR convencional + Secuenciación de ADN

2 a 10 días

(dependiendo del país donde se secuencia)

Requiere capacitación técnica especializada para el manejo de equipos y reactivos de secuenciación

Sensibilidad:

Alta

Especificidad: Muy alta (Muy precisa)

Según Lacey et al. (2001)

Valderrama-Aravena et al. (2014)

Chowdhury y Yan (2021)

Córdova-Campos et al. (2023)

Córdova-Campos et al. (2025)

 

*PCR convencional – RFLP

(Este trabajo)

*2 a 4 horas

*Requiere capacitación técnica especializada para el manejo de equipos y reactivos de extracción de ADN y amplificación de genes

*Sensibilidad: Moderada

*Especificidad: Moderada a alta

*Menos precisa que la secuenciación (puede haber patrones similares).

Perteguer (2004)

Campos-Herrera, (2006)

Susurluk et al. (2007)

Montero et al. (2017)

Gao et al. (2023)

Ruiz-Polo, Santillán-Valdivia et al. (2024)

Ruiz-Polo, Luis Arismendiz et al. (2024)

Andree et al. (2024)

 

(*) indica la técnica molecular In silico analizada en el presente estudio.

Sensibilidad: detectar verdaderos positivos.

Especificidad: excluir falsos positivos.

Andree et al. (2024) han reportado que los análisis basados en sitios de restricción, mediante PCR-RFLP, constituyen una estrategia eficiente para la diferenciación sexual en peces, ampliando así el espectro de aplicaciones de esta metodología en estudios de genética aplicada. Por tanto, considerando la bibliografía consultada, los resultados obtenidos en el presente estudio pueden ser dilucidados (Tabla 3). En cuanto a la digestión enzimática del gen 18S ARNr en el que se identificaron los sitios de restricción MslI, NruI, Tsp45I y BseRI para Heterorhabditis indica, y BglII, FokI y BstXI para Heterorhabditis bacteriophora, estudios previos han reportado que el sitio de restricción AluI se localiza en una región genética que permite discriminar entre nematodos entomopatógenos como Heterorhabditis bacteriophora y Heterorhabditis indica. No obstante, dicha identificación se ha realizado empleando como marcador molecular el gen 28S del ARN ribosomal (Rodríguez, 2019). Según Lacey et al. (2001), diversos métodos y marcadores moleculares han sido previamente empleados no solo con fines de diagnóstico de especies crípticas, poblaciones y cepas de nematodos, sino también para el análisis de sus relaciones filogenéticas y patrones evolutivos. Esto es respaldado por autores como Peteira et al. (2014), quienes señalan que, entre los métodos mayormente utilizados para identificar nematodos, se encuentra la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sus dos variantes, la PCR-RFLP y la amplificación de ADN polimórfico al azar (RAPD), ya que puede ser usados de forma fácil por personas no expertas. Esto coincide con estudios de la última década en los que se ha trabajado como técnica molecular la PCR-RFLP para identificar especies de nemátodos entomopatógenos como Steinernema feltiae Heterorhabditis bacteriophora (Campos-Herrera, 2006; Susurluk et al., 2007).   

CONCLUSIONES     

  


Los resultados permitieron la identificación de sitios de restricción en una longitud de 850 pb del gen 18S ARNr en Heterorhabditis indica (MslI, NruI, Tsp45I, BseRI) y Heterorhabditis bacteriophora (BglII, FokI, BstXI), con los que se obtuvieron fragmentos de ADN (RFLP) que permiten su identificación molecular. Esto respalda su aplicación como una alternativa molecular eficaz y accesible para la diferenciación de especies de nemátodos, especialmente en contextos con limitaciones tecnológicas para la secuenciación de ADN, debido a su bajo costo y simplicidad operativa.

Por otro lado, el presente estudio presenta como limitación el análisis de longitudes polimórficas del gen 18S ARNr en nematodos nativos del departamento de Tumbes, por lo que los resultados obtenidos son directamente aplicables a poblaciones de Heterorhabditis indica y Heterorhabditis bacteriophora presentes en dicha región. Sin embargo, la metodología puede ser reproducida en otras zonas geográficas mediante la secuenciación del mismo gen y la evaluación de sus patrones de restricción, permitiendo validar su aplicabilidad en distintos contextos ecológicos.

En ese sentido, se espera que este estudio in silico contribuya como una herramienta alternativa para programas de vigilancia fitosanitaria en el Perú, facilitando la identificación rápida de nematodos de interés agrícola. Asimismo, se recomienda la aplicación de la técnica PCR-RFLP en áreas específicas donde aún existen vacíos de cono-cimiento, tales como: (i) la caracterización mole-cular de nematodos entomopatógenos nativos en agroecosistemas poco estudiados, (ii) la dife-renciación de especies crípticas o filogenética-mente cercanas que presentan ambigüedad morfológica, (iii) el monitoreo de la variabilidad genética de poblaciones de nematodos utilizadas en programas de control biológico, y (iv) la detección temprana de especies invasoras o introducidas en sistemas agrícolas. Estas aplica-ciones permitirían fortalecer el conocimiento taxonómico y ecológico de estos organismos, así como optimizar estrategias de manejo agroecológico sostenible.

 

AGRADECIMIENTOS

 

A la Universidad Nacional de Tumbes por la provisión de las cepas de nematodos utilizadas en el presente estudio y a la Estación Experimental Agraria (EEA) Los Cedros por el acceso a estereoscopios y microscopios electrónicos empleados en el fotoregistro de nematodos.


 

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